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标题: 请指点细胞生物学都包括哪些技术 [打印本页]

作者: suoyigao    时间: 2009-1-14 13:22     标题: 请指点细胞生物学都包括哪些技术

请问一下,细胞生物学都包括哪些技术啊?
请高手指点一下,要比较系统的全面的概括细胞生物学方面所有技术,感激不尽!
作者: guohui    时间: 2009-1-14 20:34

下面这本书的介绍里面提到了一些,可以参考下:
《现代细胞生物学技术》
本书为高等院校研究生学习细胞生物学技术用书,全书共12章,涵盖了细胞生物学经典实验方法和当今细胞生物学的一些新技术、新方法,既可用于研究生细胞生物学技术教学,又可作为细胞生物学技术工具书使用。
本书编入实验共119个,内容涉及研究显微镜与显微图像分析技术、电子显微镜技术、细胞化学技术(细胞化学、酶、免疫、荧光细胞化学)、细胞培养技术、培养细胞凋亡检测技术、细胞融合技术、细胞与细胞器的分离技术、细胞的原位杂交技术、流式细胞术、真核细胞基因转染与表达技术、哺乳动物基因敲除技术和干细胞与组织工程技术等内容。
本书对每个实验项目的原理、技术方法及注意事项都有充分的阐述,并附有大量彩色显微照片,以加深感性认识。本书注重体现理论意义和实际应用价值,适用于生物学、医学、农学、师范院校的教师、研究生以及科研人员使用。

作者: tyythr    时间: 2009-1-14 21:51

细胞生物学研究技术
一、细胞形态结构的观察方法
(一)、光镜技术
1、几种常见光学显微镜
A 普通光学显微镜
普通生物显微镜由3部分构成,即:
①照明系统,包括光源和聚光器;②光
学放大系统,由物镜和目镜组成,是显
微镜的主体;③机械装置,用于固定材
料和观察方便。
B 暗视野显微镜
使用特殊的照明方法,使照明光线
不直接进入物镜,只允许被标本反射和
衍射的光线进入物镜,因而视野的背景
是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种
显微镜能见到小至4~200nm的微粒子,
分辨率可比普通显微镜高50倍。
应用:观察未经染色的活体或胶体粒子。
C 相差显微镜(PCM)
1953年获得诺贝尔物理奖,相差显
微镜的基本原理是,把透过标本的可见
光(直射光和衍射光)的光程差变成振
幅差,从而提高了各种结构间的对比
度,使各种结构变得清晰可见。
应用:观察未经染色的标本和活细胞。
D 倒置显微镜
组成和普通显微镜一样,只不过物
镜与照明系统颠倒,前者在载物台之
下,后者在载物台之上,用于观察培养
的活细胞,具有相差物镜。
E 荧光显微镜
细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫
外线照射后可发荧光;另有一些物质本
身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或
荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发
荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行
定性和定量研究的工具之一。
F 微分干涉差显微镜(DIC显微镜)
能显示细胞结构的三维立体投影影
像,立体感强,用于研究活细胞中较大
的细胞器,与录像设备结合,可观察活
细胞中的颗粒及细胞器的运动。
G 激光共聚焦扫描显微镜(LSC显微镜)
可改变观察的焦平面,因而能进行
“光学切片”,观察较厚样品的内部结构。
将改变焦点获得的一系列细胞不同平面
上的图像叠加后,可重构出样品的三维
结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于
观察细胞形态,也可以用于细胞内生化
成分的定量分析、光密度统计以及细胞
形态的测量。
2 光镜标本的制备
以石蜡切片为例:
材料处理固定脱水包埋
切片染色观察
染色剂:普通染色剂,荧光染色剂
3 光镜技术的应用
A 观察活细胞的形态结构,生命运动,
细胞周期。
B 细胞器的定位及功能研究。
C 基因产物与大分子物质的定位及定量。
D 监测细胞代谢活动。
(二)、电镜技术
1、透射电子显微镜(TEM)
透射电子显微镜以电子束为光源,由于电
子束的波长要比可见光和紫外光短得多,并且
电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反
比,也就是说电压越高波长越短,因而使其分
辨力大大提高,目前TEM的分辨力可达0.2nm。
电子显微镜的放大倍数最高可达近百万
倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真
空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
2 扫描电子显微镜(SEM)
扫描电子显微镜(SEM),可用来观察
标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的
电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电
子,次级电子的多少与电子束入射角有关,也
就是说与样品的表面结构有关,次级电子由探
测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,
再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制
荧光屏上电子束的强度,显示出与电子束同步
的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本的
表面结构。
3 扫描透射电子显微镜(STEM)
是唯一不需要染色、固定而能够直接观
测单个生物分子的仪器。世界上仅有几台。
4 扫描隧道显微镜(STM)
获1986年诺贝尔物理学奖。
可用来显示晶体表面原子布阵。固态、
液态和气态三态物质均可进行观察,能直接观
察生物大分子的原子布阵,也能观察一些生物
结构的原子排列,有助于把生物学研究推进到
纳米科学水平。
5 冷冻断裂、冷冻蚀刻电镜技术
冰冻蚀刻亦称冰冻断裂。标本置于-
100˚C的干冰或-196˚C的液氮中,进行冰
冻。然后用冷刀骤然将标本断开,升温
后,冰在真空条件下迅即升华,暴露出
断面结构,称为蚀刻。蚀刻后,向断面
以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角
喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用
次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜
剥下来,此膜即为复膜。复膜显示出了
标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影
像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
作者: tyythr    时间: 2009-1-14 21:52

二、生物化学与分子生物学技

(一)、细胞化学技术
组织化学或细胞化学染色(histochemical or
cytochemical staining)是利用染色剂可同细
胞的某种成分发生反应而着色的原理,对某种
成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方
法对细胞的各种成分几乎都能显示,包括有无
机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
(二)、免疫细胞化学
免疫细胞化学(immunocytochemistry)
是根据免疫学原理,利用抗体同特定抗
原专一结合,对抗原进行定位测定的技
术。抗原主要为大分子或与大分子相结
合的小分子;抗体则是由浆细胞针对特
定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体
结合上标记物,再与组织中的抗原发生
反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗
原存在于组织中的部位。
(三)、显微光谱分析技术
细胞中有一些成分具有特定的吸收光
谱,核酸、蛋白质、细胞色素、维生素
等都有自己特征性的吸收曲线。例如,
核酸的吸收波长为260nm,而蛋白质的
则为280nm。有的成分经组织化学染色
后,对可见光有特定的吸收光谱。根据
细胞成分所具有的这种特性,可利用显
微分光光度计对某些成分进行定位、定
性,甚至定量测定。
(四)、放射自显影术
放射自显影术(radioautography;
autoradiography)用于研究标记化合物在机体、
组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、
更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将
放射性同位素(如14C和3H)标记的化合物导
入生物体内,经过一段时间后,将标本制成切
片或涂片,涂上卤化银乳胶,经一定时间的放
射性曝光,组织中的放射性即可使乳胶感光。
然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗
粒,即可得知标本中标记物的准确位置和数
量,放射自显影的切片还可再用染料染色,这
样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进
行定位或相对定量测定。
(五)、分子杂交技术
分子杂交技术(molecular hybridization)
是在研究DNA分子复性变化基础上发展
起来的一种技术。其原理是,具有互补
核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片
段,在适当条件下,通过氢键结合,形
成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂
交的双链分子。这种技术可用来测定单
链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
作者: tyythr    时间: 2009-1-14 21:54

三、细胞分离技术
(一)、离心技术
离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基
体、溶酶体和微体,以及各种大分子基
本手段。一般认为,转速为10~25Kr/min
的离心机称为高速离心机;转速超过
25Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速
离心机。目前超速离心机的最高转速可
达100Kr/min,离心力超过500Kg。
1、差速离心
在密度均一的介质中由低速到高速逐级
离心,用于分离不同大小的细胞和细胞
器。
2、密度梯度离心
用一定的介质在离心管内形成一连
续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液
或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离
心力场的作用使细胞分层、分离。这类
分离又可分为速度沉降和等密度沉降平
衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯
化铯,蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的
介质要求:1)能产生密度梯度,且密度
高时,粘度不高;2)PH中性或易调为
中性;3)浓度大时渗透压不大;4)对
细胞无毒。
(二)、流式细胞术
流式细胞术是对单个细胞进行快速
定量分析与分选的一门技术。在分析或
分选过程中,包在鞘液中的细胞通过高
频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞
的液滴,在激光束的照射下,这些细胞
发出散射光和荧光,经探测器检测,转
换为电信号,送入计算机处理,输出统
计结果,并可根据这些性质分选出高纯
度的细胞亚群,分离纯度可达99%。
(三)、细胞电泳
在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷,能
在外加电场的作用下发生泳动,这种现象称为细胞
电泳(cell electrophoresis)。引起细胞电泳的电
位值称为ξ电位。各种细胞或处于不同生理状态的
同种细胞荷电量有所不同,故在一定的电场中的泳
动速度不同。在恒定的电场条件下,同种细胞的电
泳速度相当稳定,因而可通过测定电泳速度来推算
出细胞的ξ电位。ξ电位常因细胞生理状态和病理
状态而异,因此在诊断疾病上有一定价值。此外由
于不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同,细胞
电泳尚可用来分离不同种类的细胞,例如可把淋巴
样细胞与造血细胞分开。
作者: tyythr    时间: 2009-1-14 21:55

四、细胞培养与细胞杂交
高等生物是由多细胞构成的整体,在整体条件
下要研究单个细胞或某一群细胞在体内(in
vivo)的功能活动是十分困难的。但是如果把
活细胞拿到体外(in vitro)培养进行观察和研
究,则要方便得多。活细胞离体后要在一定的
生理条件下才能存活和进行生理活动,特别是
高等动植物细胞要求的生存条件极其严格,稍
有不适就要死亡。所以细胞培养技术(cell
culture)就是选用最佳生存条件对活细胞进行
培养和研究的技术。
通过培养和诱导,两个或多个细胞合并
成一个双核或多核细胞的过程称为细胞
融合(cell fusion)或细胞杂交(cell
hybridization)。




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