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希望大家将问题描述的尽量详细一些

生物秀Western Blotting专题:
http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm


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非常感谢fangweibin发起这个帮助帖,欢迎大家就Western blot实验中遇到的问题跟帖提问。
希望大家将问题描述的尽量详细一些。

已有10人评分 秀基因 秀蛋白 收起 理由
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总评分: 秀基因 +42 秀蛋白 +10 查看全部评分

共 1188 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-10-26 09:08

六仔1994 生物秀才 发表于 2016-9-6 09:24:46 | 显示全部楼层

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大家好 我最近做wb两个月,什么也不出。。起初怀疑是抗体,但是使用别人的出的很稳定的抗体,还是不出;后想抗体稀释液的问题,再重新配置tbst,再稀释还是不出;再用什么处理都没有的阳性对照验证,出了,但是再用处理过的细胞蛋白和阳性对照一起去跑的时候,又不出了。。。这过程中不存在抗体使用过久,因为我每次只用1毫升左右稀释液,因此都是现用现配的。。所有东西都换新,都不可以。。。求帮助。。。并且只压内参都没有。。。
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山猪の日子 生物秀才 发表于 2016-10-9 19:03:42 | 显示全部楼层

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急求急求:请问,一个六孔板采用RIPA裂解液提取动物细胞总蛋白一般蛋白浓度大概可以达到多少?电泳的时候加多少样本为好呢?
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birddragon 生物秀进士 发表于 2009-7-8 17:17:32 | 显示全部楼层
二抗如果特异性非常好,能不能不加BSA或奶粉呢?
海燕之梦 生物秀才 发表于 2009-7-8 18:50:10 | 显示全部楼层
page 电泳时很容易出现“牵手”现象,如何改进!蛋白显影以后,会出现弥散状,而非界限十分清晰的条带,(放胶片时没有移动)是何故?难道是蛋白砖模过程中扩散了!
miumiu 生物秀才 发表于 2009-7-21 00:43:50 | 显示全部楼层
问题同楼上,显影后会出现十分清晰的条带所谓的“杂带”,目的条带和内参都是这样的。谢谢~~
fangweibin 生物秀版主 发表于 2009-7-21 08:01:03 | 显示全部楼层
二抗如果特异性非常好,能不能不加BSA或奶粉呢?
birddragon 发表于 2009-7-8 17:17


可以
二抗孵育时间一般孵育30min左右就可以了
但是最好还是在封闭体系中加二抗
good luck
已有2人评分 秀基因 秀蛋白 收起 理由
smile122 +1 赞一个!
bbioo +10 +5 热心助人,非常感谢!

总评分: 秀基因 +11 秀蛋白 +5 查看全部评分

fangweibin 生物秀版主 发表于 2009-7-21 08:02:08 | 显示全部楼层
page 电泳时很容易出现“牵手”现象,如何改进!蛋白显影以后,会出现弥散状,而非界限十分清晰的条带,(放胶片时没有移动)是何故?难道是蛋白砖模过程中扩散了!
海燕之梦 发表于 2009-7-8 18:50


蛋白量比较大
另外把分离胶凝固时间延长一点
fangweibin 生物秀版主 发表于 2009-7-21 08:03:13 | 显示全部楼层
问题同楼上,显影后会出现十分清晰的条带所谓的“杂带”,目的条带和内参都是这样的。谢谢~~
miumiu 发表于 2009-7-21 00:43


1,抗体质量不好,特异性不高
2,抗体的稀释比例不合适,要稀释一下
myxiyi 生物秀才 发表于 2009-7-25 11:25:38 | 显示全部楼层
之前有一批标本准备做冰冻切片免疫组化的,后来没做!
标本处理程序,4%多聚甲醛经心灌注,取闹后置于中性缓冲福尔马林中后固定20小时,置于梯度蔗糖脱水,后入-70保存,请问这样的组织能不能做Western?
只写!
fangweibin 生物秀版主 发表于 2009-7-29 09:26:06 | 显示全部楼层
之前有一批标本准备做冰冻切片免疫组化的,后来没做!
标本处理程序,4%多聚甲醛经心灌注,取闹后置于中性缓冲福尔马林中后固定20小时,置于梯度蔗糖脱水,后入-70保存,请问这样的组织能不能做Western?
只写!
myxiyi 发表于 2009-7-25 11:25


没有处理过这样的样品
从WB的原理上来说应该是可以的
windwhk 生物秀才 发表于 2009-7-29 22:04:23 | 显示全部楼层
我ECL显色肉眼可观察到条带。我用柯达的胶片压片2分钟,显影1分钟,却没有条带。而且整张片子都是黑的。胶片是3年前买的,有问题吗。
另外,我在Western Blotting专题看到ECL直接成像的,也听说这种方法。不知如何操作,还是要特定的成像系统?
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