嗅鞘细胞培养及特性研究进展 细胞培养, 特性, 进展, 研究 本帖引用网址：http://bbs.bbioo.com/thread-30326-1-1.html

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郭钦佩1  泰安市中医医院骨科  李书忠2   青医附院骨科副主任。


       嗅神经系统是极少数可以再生的中枢神经系统之一，其再生能力与嗅球胶质的一种细胞嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)密切相关，嗅神经再生的过程中，OECs不仅可诱导再生神经纤维长入中枢的嗅球，对其具有保护作用，而且可分泌多种生物活性物质。同时有文献[1~3]表明无论在体内或体外OECs都有促进中枢神经元轴突生长的作用，且强于雪旺细胞。OECs的这些神经生物学特性，引起了人们的极大兴趣，以修复治疗神经系统损伤为目的的细胞移植研究已成为近期的研究热点，OECs则成为主要侯选细胞之一。但由于OECs的特殊分布(分布于嗅球的嗅神经层及嗅神经)，给其分离、培养及深入研究带来极大困难。
目前，关于OECs的培养，由胚胎、新生期、成年大鼠和小鼠的嗅球取材均已见报道[4]。供体组织年龄的不同，培养细胞的性质也有一定的差异[5，4]。成熟嗅球从外到内可分为以下几层：嗅神经层、小球层、外丛层、僧帽细胞层、内丛层、粒层、髓层和室管膜层。嗅球成鞘胶质细胞包绕嗅神经元的轴突经外周部分进入中枢神经系统，终止于嗅球的嗅神经层和小球层[5]。在手术显微镜下取嗅球的最外两层做培养，可以得到含量较高的OECs。
       Burry等[6]也曾经进行过嗅球神经元体外培养的研究，他们采用机械方法解离嗅球，但是经过这种机械分散方法，细胞破碎较多，细胞活性差。在体外神经元培养过程中采用胰蛋白酶化学消化和机械消化，并在显微镜下密切观察，可以避免消化不充分和过度，使细胞活性提高[7]。
      嗅鞘细胞分离有传统分离法[8]：嗅球置于少量ACSF（人工脑脊液）中(4℃冰浴)，在解剖显微镜下，将位于嗅球最外层的嗅神经层、嗅神经及包被的脑膜轻轻剥下，用ACSF洗2次，组织块用0.125%胰酶(Sigma)37℃消化20min，经胰酶消化的组织块再移至完全培养液(DMEM：胎牛血清=9:1美国GIBCO公司)中，用滴管轻轻吹打组织块使之形成细胞悬液备用。分层消化法：整个嗅球置于0.125%胰酶中，37℃消化15min（不时摇动），取出含有细胞的酶液，终止酶反应。剩余的嗅球再用酶消化，重复以上操作6次，细胞悬液分别收集于6支小试管内备用。直接挤压法：嗅球置于少量ACSF中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，将剩余的片状组织块转移至另一试管内，用ACSF洗2次，组织块用0.125%胰酶（Sigma）37℃消化20min，经胰酶消化的组织块再移至完全培养液中，用滴管轻轻吹打组织块使之形成细胞悬液。
     传统分离方法一般分为两大类，一类是酶消化法，另一类是利用OECs对p75NGFR有特异免疫性的特点[9、10]，采用免疫抗体包被培养瓶方法、磁珠悬浮法[11]和流式细胞仪分离法[12]将OECs分离。产量上，直接挤压法最高，传统分离法次之，分层消化法最低。传统方法（包括免疫抗体包被培养瓶方法、磁珠悬浮法和流式细胞仪分离法）分离过程复杂，操作时间长，需要特殊仪器及器械，特别是含OECs丰富的嗅神经层非常薄，即使在解剖显微镜下也无法与其它组织区别，嗅神经更是难于找到，分离效果很差。直接挤压法特点是操作简单易行，省时，不需要特殊仪器设备，且在获得细胞的数量上略多于传统分离法。直接挤压法优于传统方法和分层消化法。为了加快OECs的增殖速度，提高产量可以在培养液中加入一些促进细胞分裂的物质，如在培养液中加入适量的牛垂体提取物（BPE）可使OECs增殖明显加快，但因其它细胞增殖也加快，使其纯度有所下降。应用Arac纯化OECs方法简便、经济，OECs纯度可达70%左右。时一步纯化还可用Thy-1.1抗体杀死成纤维细胞，文献[13]报道纯度可达99%以上，其缺点是方法复杂、费用昂贵。
     纯化细胞的方法较多，一般有差速贴壁，化学药物法，梯度离心法，免疫亲和吸附法。以后者纯化效果最好，其纯度可达99%以上，是目前普遍采用的方法之一。但是此法步骤较为繁琐，费用高，同时细胞经过反复清洗，活性下降，于是给下一步培养带来了一定的困难。
     主要影响纯化的是成纤维细胞，在培养24-48h加入阿糖胞苷，可以有效抑制和杀灭进入分裂期的成纤维细胞，但OECs也受到一定程度的抑制[14、15]。使用BPE来促进OECs增殖，第8-16d得到生长状态良好的OECs，纯度可达80%。OECs细胞表面具有特异性的低亲和神经营养因子受体（L-NGFR），可以特异性的与LNGFR抗体结合，为免疫纯化提供了基础，免疫纯化后纯度可以提高到98%。为进一步的实验研究奠定了基础。
原代培养嗅鞘细胞多见两种形态的细胞：一种为单极、双极或多极细胞，带有细长的突起;另一种为所谓“煎蛋样”细胞，扁平形，胞质少极化，边缘不规则。在多种免疫组化反应中，尽管这两种细胞均表达GFAP、p75NTR（p75-nerve growth factor receptor）和PSA-N-CAM（polysialic acid-containing molecule，多涎酸包含分子）等，但因这两种细胞的免疫组化特性、形态及功能并不完全一致，学者们建议把OECs分为两个亚型[10]，前者的特性及形态偏向于Schwann细胞，因此被称为“Schwann-like”OECs，即S细胞;而后者的某些特性与星状胶质细胞（astrocyte）相似，因此被称为“astrocyte-like”OECs，即A细胞[16]。
据Ramn-Cueto报道[4]，培养的成鞘细胞按其形态可分为3种：双极或梭形（fusiform）、多突起形（process bearing multipolar）和扁圆形（roundflat）或油煎蛋形（fried egg-like）[17]。
众多学者的研究表明，无论从发育起源还是从免疫组化特性上分析，OECs是单独一类性质独特的胶质细胞[18]。从发育起源上看，OECs起源于嗅神经板，而少突胶质细胞、星状胶质细胞和小胶质细胞都来源于神经管[5]。从免疫组化的特性来看，HNK-1（human natural killer-1，人类自然杀伤细胞-1）是标记Ⅱ型星形胶质细胞、少突胶质细胞和Schwann细胞（O-2A谱系）的抗体；Gal-C（anti-galactocerebroside，抗半乳糖脑苷酯）是标记少突胶质细胞和Schwann细胞的抗体，这两种抗体都不标记OECs[18]。另外，大多数OECs对髓鞘结合蛋白（myelinate-bind protein，MBP）呈阳性反应，而星形胶质细胞总是呈阴性反应。OECs对纤维粘连蛋白（fibronectin）大多数呈阳性反应，Schwann细胞则呈阴性反应[19]。
     OECs表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），在血管壁形成终足，以及参与形成胶质界膜，此界膜大致勾勒出了嗅神经轴突与嗅球颗粒层嗅小球的交界线[19]，OECs在免疫细胞化学超微结构特征以及与轴突的功能联系方面与星形胶质细胞存在明显不同。OECs对神经生长因子受体（P75NGR）Laminin细胞粘附分子L1（CAML1）和Vimentin有阳性免疫反应[4，20]。在体外，OECs对微管相关蛋白2（MAP-2）为免疫反应阴性，而这些抗原是星形胶质细胞的标记物[4]。在电镜水平，OECs核呈锯齿状，染色质分布不均，高电子密度的胞浆中有微丝散在分布而星形胶质细胞核呈卵圆形，胞浆电子密度低，中间丝成束分布[13]在嗅觉传导路上，OECs成束包裹嗅神经轴突，引导它们穿过PNS与CNS移行区和蛛网膜下腔，进入嗅球体外OECs与神经元共同培养时，它可以包裹神经元轴突形成髓鞘，支持神经突起的生长[22];而星形胶质细胞在体外对神经元的存活和轴突的生长只有一般的营养作用，不形成髓鞘样结构。OECs不具有少突胶质细胞的免疫学特征，虽然它能表达O-2A（少突胶质细胞的标记物），但缺乏其它相关标记物的表达，包括对Rip、抗半乳糖脑苷酯、HNK-1、CD-3等的表达[17]。
OECs有时被称为嗅觉系统的SCs，但两者在细胞来源和免疫学特性上明显不同SCs来源于神经脊细胞，而OECs来源于嗅基板[4]两者对L1、P75NGR和A5E3均呈阳性免疫反应，不同的是，OECs表达中枢形式的GFAP，SCs不表达；OECs不表达HNK-1和半乳糖脑苷酯，而SCs则均能表达[23]。
      OECs可分泌神经营养因子、轴突生长刺激物质，能促进轴突的再生和髓鞘的形成[7，14]嗅觉系统的免疫组化和原位杂交研究提示OECs不仅可以分泌BDNF、NGF神经营养因子-3（neuortrophin factor 3，NT-3）和NT-4[17]，还能表达Laminin、L1、纤粘连蛋白，S100、胶质源性连接素（Glial-derived nexin）和神经细胞粘附分子（N-CAM）所有这些因子均能支持轴突的延伸[7，18]。
      在体外，用不同方法分离纯化的OECs都支持轴突的延伸，在OECs上培养的神经元存活率增高，而且有更长的突起[18，19] 虽然目前OECs促进轴突再生的内在机制还不完全清楚，大量制备OECs的方法尚不完善;但对它的深入研究必将有助于理解中枢神经再生的机制，将SCI的治疗带到一个崭新的水平。
      从第一次嗅鞘细胞的生物学文章发表已经有二十余年历史了［24］。1994年Ramon Cueto和Nieto-Sampedrol发表了第一篇关于嗅鞘细胞有助于感觉轴突长入脊神经切断术的文章，在此之前Doucette实验室发表了嗅鞘细胞移植人脑后存活的文章［25］，Raisman小组发现皮质脊髓束损伤后行嗅鞘细胞移植可以使神经功能恢复［3］。从1997年到现在的9年里有50篇文章是关于嗅鞘细胞移植的；51篇是描述嗅鞘细胞生物学特征的，还有31篇是综述性文章，而且大多是和神经修复有关。国内黄红云教授率先开展了嗅鞘细胞的临床试验，并获得了满意的临床效果［26］。嗅鞘细胞已逐渐引起了科学界的重视，特别是在脊髓损伤修复领域，被认为是治疗脊髓损伤最具潜力的细胞。
      嗅鞘细胞是一种嗅神经的支持细胞，它包被神经轴突迁徙入脑，在颅底它和嗅球的僧帽细胞相结合［27］。分布于嗅神经的全长，从嗅上皮基底膜一直到嗅球，主要位于嗅神经的纤维层，至于是否深入到颗粒层仍存在争议［28］。OECs源于嗅上皮的祖细胞（progonitor cell）,在营养信号的引导下向嗅球迁移。
   嗅鞘细胞具有雪旺氏细胞和星形胶质细胞的特性，但总的表现更趋于前者［29］，它有两个独特的特征。第一，它不仅存在于外周神经（雪旺氏细胞），而且存在于中枢神经（星形胶质细胞）；第二，嗅粘膜具有终生再生能力，包括人类的嗅鞘细胞［30］，这种再生是嗅鞘细胞参与高效调控的过程，尽管现在不清楚具体的机制。嗅鞘细胞不同于星形细胞和雪旺氏细胞，但同时兼有这两种细胞的特性，有象雪旺氏细胞有助于轴突生长的作用，但比雪旺氏细胞更能使轴突长距离生长，即具有更强的迁徙性［31］；也有象星形胶质细胞一样对神经元的存活及轴突的生长具有营养作用，但嗅鞘细胞还能够包裹神经元形成髓鞘，支持神经突起的生长［31］。正是这两种特性使得嗅鞘细胞成为神经修复的最佳选择［32］。已发表的53篇关于嗅鞘细胞移植的文章，也强有力的证明了嗅鞘细胞是神经修复的最佳材料。
   

参考 文 献

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