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我总结的western-blot实验经验

dealer 于 2018-5-9 09:10 发表在 [分享] [复制链接]

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       我做了很久的WB,最大的一个难点感觉在于样品制备上!蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做WB的 话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loading buffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loading buffer100度充分变性,再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
      另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于WB的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了。
       还有一个就是显影液的选择。如果选择了不合适的显影液,就会造成背景高,灵敏度差,易淬灭,发光时间短等问题。建议选择合适的显影液。我用的是Enlight-plus这一款ECL发光液,超灵敏的,发光时间也挺长,最后出来的图像很清晰。
       最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等。

点评

宁泽明 海!外直播 t.cn/RxmJTrC 禁闻视频 t.cn/RJ7ga9s 忽然想通很多事情:它们亲人财富都转移到国外,如果控制不住局面,会随时放弃这里!你可千万别高兴,由于对这里没有归属感,它们对待这里的一切,会出人意料的残酷无底线   发表于 2018-5-14 08:21

共 1 个关于本帖的回复 最后回复于 昨天 16:29

wx_lPhBT 生物秀才 发表于 昨天 16:29 | 显示全部楼层

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