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海马神经元细胞培养

肖帅 于 2018-3-31 10:09 发表在 [分享] [复制链接]

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海马神经元细胞分离自海马体;
海马体(Hippocampus),又名海马回、海马区、大脑海马,海马体主要负责记忆和学习。
海马神经元细胞是海马区的主要细胞组成,主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节、是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。
海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用(细胞因子)的有效细胞模型,其在神经生物学,发育生物学体外实验研究中已被广泛应用。
实验操作过程

1、包被:培养前晚上将培养瓶(板)用多聚赖氨酸包被10 min,吸除,无菌操作台上15min自然晾干,置于培养箱中备用;

2、取脑:选取新生24 h的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮、颅骨,用弯镊拉开脑区视野,小心取出全脑,D-hanks液洗数次;(预先准备至少4把眼科剪刀,分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作)

3、分离:以脑中线为起点,小心拨开大脑颞叶皮层,暴露出新月状海马回,小心夹出海马组织,置于冰浴的D-hanks液中,仔细剔除微血管,用充分剪碎组织;

4、消化:加入同体积0.125%的胰蛋白酶,瓶口用锡箔纸盖上,37 ℃培养箱内消化20 min左右,期间轻摇数次;

5、过滤:加入数滴胎牛血清终止消化,用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟,至液体成米糊状即停止吹打,动作要轻柔,用150目网筛过滤,收集细胞悬液;

6、接种:以1100 rpm离心5 min,倾去上清,用DMEM/F12培养液重悬细胞,轻轻吹打,台盼蓝染色快速计数,根据计数结果,调整细胞终浓度为1 00000个/ml,加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶(板)中,置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养;12小时内禁止晃动

7、换液:接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液,第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞的过度生长,随后每3 d半量换液。

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此外,原代培养的海马组织由多种细胞构成,如成纤维细胞、胶质细胞等,成分复杂,因此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。

可以采取以下措施来达到细胞纯化:

(1)海马组织取材时组织定位准确,由于海马游离于大脑皮层,这一点容易做到;

(2)消化前,细心剔除微血管;

(3)过滤时选择150-200目筛网,尽量使培养的细胞呈单个或数个成团;

(4)接种24 h时需全量换培养基,除去未贴壁的死细胞;

(5)接种48 h时加一定浓度的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞(胶质细胞和少许成纤维细胞)的过度生长。

除菌剂2.jpg
   §   产 ● 品 ● 简 ●    §   
① NocardTMRid(支原体去除剂)
(1)将Nocard Rid与完全培养液按1:800~1000比例稀释,加入细胞正常培养;
(2)根据细胞污染的严重程度,处理3~6次即可完全清除细胞支原体污染问题。


② PreNocardTMRid(支原体预防剂)
(1)将PreNocard Rid与完全培养液按1:1000~2000比例稀释,加入细胞正常培养;
(2)有效预防和抑制细胞出现支原体污染。


MycoTestTM Kit(支原体检测试剂盒)
MycoTest Kit是利用降落聚合酶链式反应技术(TD-pcr)对支原体16S rRNA 基因高度保守区域特异性片段进行扩增检测。该方法灵敏度高,特异性强,可用于各种生物材料(如细胞培养基、实验动物分泌物、动物血清等)支原体感染的检测。


④ NabactTM Rid(黑胶虫去除剂)
在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动(类似布朗运动),这就是黑胶虫。
(1)推荐Nabact Rid的稀释比例为1:500-800,例如:5 mL培养基加入10 μL的Nabact Rid;
(2)弃去旧的培养基,用PBS将细胞清洗干净,再加入新鲜的含有Nabact Rid的培养基,2天1次,连续处理3个周期。


⑤ PreNabactTM Rid(黑胶虫预防剂)
(1)推荐PreNabact Rid用培养液稀释的使用比例为1:800-1000,加入细胞培养;
(2)有效预防细胞出现黑胶虫污染。


CandidaTM Rid(念珠菌清除剂)
Candida Rid 通过特异性的破坏真菌细胞壁的结构,让真菌细胞失去固有形态及完整性,从而影响念珠菌属的正常代谢、离子交换和渗透压,让细胞彻底摆脱念珠菌的困扰,确保细胞的健康生长。
(1) 用PBS冲洗细胞3~5次,每次都从一个方向冲洗倒掉;
(2)推荐将Candida Rid与完全培养液按1:500比例稀释,加入细胞正常培养;


⑦ PaebaclTM Rid(杆菌去除剂)
杆菌(Bacillus Cohn)呈杆状,革兰氏染色阳性、阴性或可变,以周生鞭毛运动。当细胞出现杆菌及常见细菌污染,且对各种抗生素都有很强的耐药性,很难清除,且增殖很快跟细胞竞争营养,培养液很快会变混浊。
(1)发现细胞有杆菌及常见细菌污染,弃掉培养基,用pbs清洗3遍;
(2)然后按1:1000 比例加入Paebacl Rid 试剂,即:边加边摇匀;
(3)每天处理一次,Paebacl Rid 连续处理三天,即可完全清除杆菌污染。


⑧ 细胞房除菌剂
(1)在细胞房及实验室空间,喷两层层即可快速杀灭常见污染源;
(2)喷洒本品后,需将细胞房或实验室密闭10-20min后使用。


⑨ 培养箱除菌剂
(1)在CO2培养箱内壁及空间,喷三层即可快速杀灭常见污染源,也可对环境空气灭菌;
(2)经试验验证,处理培养箱污染对常见细胞培养无任何影响,无需将细胞移出培养箱;
(3)建议CO2培养箱每1-2周处理一次。


⑩ 培养箱水盘抑菌剂
(1)首次使用,请先将培养箱水盘清洗干净,然后推荐使用培养箱除菌剂(NZF602)或75%酒精擦拭;最后按照1:100的比例向水盘中加入水盘抑菌剂处理过的水(即:1L水加入10 mL水盘抑菌剂);
(2)再次使用,可直接按照1:100的比例向水盘中加入本品,每7-10天处理一次。


⑾ 水浴锅抑菌剂
(1)直接按照1:1000的比例向水浴锅中加入本品,每7-10天处理一次。


联系方式:

南京知凡生物技术有限公司

Tel:025-68027363

QQ:1621855805

E-mail:sales@zfdows.com

Web:www.zfdows.com

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