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动物检验检疫技术

biogoogle 于 2008-9-16 20:53 发表 [复制链接]

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病毒蚀斑技术

1952年,Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学,从而使病毒蚀斑技术 (Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。

(一) 原理 病毒感染细胞后,由于固体介质的限制,释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期,便形成一个局限性病变细胞区,此即病毒蚀斑。从理论上讲,一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的,因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中,常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况,影响滴定的准确性和克隆的纯一性,为此,接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒,如MDV,需用单层细胞;对细胞释放性病毒,即可用固相介质悬浮的细胞,也可用单层细胞,但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上,以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定,大病毒用浓度较低的介质,小病毒用浓度较高的介质,以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察,1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察,常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红,病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如,3个细胞瓶的平均蚀斑是58,接种量为0.2ml,病毒的稀释度为2.5×103 ,则病毒原液的滴度为:
58÷0.2×2.5×103 =7.25×105 (PFU/ml)
(二) 技术应用 蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定,也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
1.病毒生物学纯化 (Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降,因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时, 有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒, 亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化, 必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个,挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为,中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此,加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。
2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test) 蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法,试验以使蚀斑数减少 50%的血清稀释度作为其中的效价。 试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作, 接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37 ℃二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。
由于本试验的操作比较繁锁,目前在国内极少应用,国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法,仅在OIE国际动物卫生法典(第六版)中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。
(三) 操作实例
1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化
(1) 于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero),使形成单层。细胞培养时间约3-4天,接种量约为2 000 000/ml个细胞。选取单层细胞全部覆盖,不留有空洞的培养皿用作试验。
(2) 用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。
(3) 每个稀释度的病毒液接种3个平皿。
(4) 接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。
(5) 每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液,对照组只用细胞培养液代替,置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时,每15分钟摇动一次,以便使病毒均匀分布。
(6) 按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。
(7) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5%琼脂(预热)中,每个平皿加入7ml,置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2天,平皿需倒置。
(8) 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2%琼脂(预热)中,每个平皿加入5ml,置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱中培养至次日。
(9) 结果计算 求每组三个培养皿的蚀斑平均数,组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律 (即若10-2组平均100个蚀斑,则10-3组平均应在10个左右),否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5,即为每毫升病毒原液的蚀斑数。
(10) 选取特征性的若干蚀斑,分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒,然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。
(11) 本试验采用BHK21细胞,可应用于牛流行热病毒(BEFV)。
2.蓝舌病病毒(BTV)血清型鉴定试验(纸片法)
(1) 抗体纸片制备
① 取已知各种血清型毒株以1×107蚀斑形成单位接种绵羊, 接种后3-4周采血分离血清。
② 制备直径0.5mm的中性滤纸片,121℃15分种灭菌后保存于干燥环境。
③ 取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干, 保存于4℃冰箱备用,使用前以灭菌水湿润。
(2) 病毒接种
① 用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21或Vero细胞使成单层。
② 以103PFU/0.2ml被检蓝舌病病毒接种于细胞上, 吸附1h。
③ 洗去未被吸附的病毒,弃去洗液。
(3) 覆盖琼脂
① 取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5%琼脂,每个平皿加入7ml,置平台冷却凝固。
② 在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片, 并做好记号。
③ 把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2天。
④ 真空吸出平皿中的滤纸片。
⑤ 取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂,每个平皿加入5ml,重新置37℃二氧化碳培养箱培养2-3天, 待明显蚀斑抑制环出现。
(4) 结果判定 出现明显抑制蚀斑形成(即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色)的免疫血清即为该被检病毒的血清型。
注:本试验方法同时可应用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 与蓝舌病病毒(BTV)的鉴别。
3.新城疫病病毒(NDV)分离
(1) 取疑似患病禽的组织用细胞培养液匀浆,离心沉淀后取上清液。
(2) 用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。
(3) 细胞长成单层后吸去培养液,向每孔滴加0.1ml被检病料, 置37℃吸附2小时后弃残液。
(4) 制备1%琼脂的BME,置40-50℃水浴待用。
(5) 吸取上述琼脂加入培养板各孔,每孔0.5ml,使冷却凝固成覆盖层。
(6) 把培养板倒置,在37℃二氧化碳培养箱培养48h。
(7) 制备含0.002%中性红的1%琼脂的BME,置40-50℃水浴待用。
(8) 吸取上述琼脂加入培养板各孔,每孔0.5ml,使冷却凝固成第二覆盖层。
(9) 把培养板倒置,在37℃二氧化碳培养箱继续培养,48小时内观察结果。
(10) 挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。
注:本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。
4.试验用各种成份的配制
(1) 细胞营养液(用于稀释病毒)

10倍199保存液
4ml

犊牛血清
0.8ml

3%碳酸氢钠
2.4ml

双蒸水
32.8ml


40ml
(2) 两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用)

10倍199保存液
20ml

犊牛血清
4ml

3%碳酸氢钠
12ml

1%二乙氨基乙基(DEAE)
10ml(可选择)

双蒸水
54ml


100ml
(置40-45℃水浴备用)
(3) 1.5%琼脂

精制琼脂糖
1.5g

双蒸水
加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟,置40-45℃水浴备用。)
(4) 含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用)

10倍199保存液
20ml

犊牛血清
10ml

3%碳酸氢钠
12ml

0.5%中性红
6ml

双蒸水
52ml


100ml
(置40-45℃水浴备用)
说明:在第二层琼脂中,中性红的最终浓度应为1:5000-1:10000。
(5) 2%琼脂

精制琼脂糖
2g

双蒸水
加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟,置40-45℃水浴备用。)

参考文献
[1].Dulbecco, Ginserg:
Virolog,Third Edition,1980

[2].Cooper: Advan. Vir. Res. 8:319,1961
[3].Schloer: Am. J. Vet. Res. 29:883,1968
[4].Fenner, Bachman: Veterinary Virology,1987
[5].殷震,刘景华: 动物病毒学,1985
[6].中华人民共和国动植物检疫总所:蓝舌病专辑,1986(6)
[7].Hsiung: Diagnostic Virology,Third
Edition,1982

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biogoogle 生物秀探花 发表于 2008-9-16 20:54:53 | 显示全部楼层

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免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术,因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质结合,用于检测或定位抗体,但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗体技术,或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂。
(一) 原理与方法 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
1.直接染色法 将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上,经一定温度和时间的染色,洗去未参加反应的多余荧光抗体,在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。直接染色法的优点是:特异性高,操作简便,比较快速。缺点是:一种标记抗体只能检查一种抗原,敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照,抑制试验对照。
2.间接染色法 如果检查未知抗原,先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应,作用一定时间后,洗去未反应的抗体,再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应,如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应,则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合,形成抗原-抗体-抗抗体复合物,再洗去未反应的标记抗抗体,在荧光显微镜下可见荧光。在间接染色法中,第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用,对抗原来说起抗体的作用,对第二步的抗抗体又起抗原作用。如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体,基他步骤和检查抗原相同。
由于免疫球蛋白有种属特异性,因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。
间接染色法的优点是既能检查未知抗原,也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体,能与在种属上相同的所有动物的抗体结合,检查各种未知抗原或抗体,敏感性高。缺点是:由于参加反应的因素较多,受干扰的可能性也较大,判定结果有时较难,操作繁琐,对照较多,时间长。间接法应设阴、阳性标本对照,还应设有中间层对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。
3.抗补体染色法 抗补体染色法简称补体法,是间接染色法的一种改良法,首先由Goldwasser等建立。本法利用补体结合反应的原理,用荧光素标记抗补体抗体,鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。染色程序也分二步:先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上,使其发生反应,水洗,然后再加标记的抗补体抗体。如果第一步中抗原抗体发生反应,形成复合物,则补体便被抗原抗体复合物结合,第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应,使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物,发出荧光。
抗补体染色法具有和间接法相同的优点,此外,还有其独特的优点:即只需要一种标记抗补体抗体,便能检测各种抗原-抗体系统。因为补体的作用没有特异性,它可以与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多,染色程序较复杂,比较麻烦。
除上述三种方法外,还有在此基础上演变出的一些方法,如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体-抗补体法等等。
(二) 荧光抗体的制备
1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此,用于免疫的抗原必须高度提纯,尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质,血清的效价与特异性是矛盾的,通常以高效价的免疫血清为好,因为用这种血清制备荧光抗体,即使其中含有少量非特异抗体,也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价,在制备免疫原时,通常采用大剂量加佐剂,长程免疫,其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份,无水羊毛脂1份,液体石蜡2份混合,待充分乳化后,免疫动物,即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清,需提纯后使用,这样不但可以提高抗体的效价,而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质,减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体,主要是IgG类,其提纯方法很多,但以饱和硫酸铵盐析法比较简便,也可用分子筛层析法(即葡聚糖凝胶过滤),以及离子交换层析法等,或先用盐析法精提,然后再经过层析柱进一步纯化。
2.荧光色素的标记 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素,必须具有化学上的活性基因,能与蛋白质稳定结合,且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyanate,FITC),四乙基罗达明(rho-damine B200,RB200)和四甲基异硫氰基罗达明(tetramethyl rhodamine isotheynate,TMRITC)。实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄一种。
(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末,分子量为389,易溶于水和酒精等溶剂中,溶解后呈黄绿色荧光,最大吸收光谱为490-495nm,FITC的溶液不稳定,易因水解或迭聚而变质,故需在配好后2h内应用。
FITC含有异硫氰基,在碱性条件下能与IgG的自由氨基(主要是赖氨酸的ε-氨基)结合,形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基,但一般最多只能标记15-20个。
① 直接标记法 取抗体球蛋白溶液10ml,碳酸盐缓冲液3ml,生理盐水17ml,混合,在4℃电磁搅拌下加FITC3mg(先溶解在3ml缓冲液中),在4℃继续搅拌4-6h,将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱,以除去未结合的游离荧光素。
② 透析标记法 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液(0.25mol/L,pH9.0调动1% (W/V ),并装入透析袋中,按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中,将透析袋浸没于FITC液中,于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L,pH7.2PBS中透析4h,将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱,去除游离荧光素。
(2) RB200标记 本品为无定形褐红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保存,分子量为580,最大吸收光谱为570nm,呈明亮的橙色荧光,因与FITC的黄绿色有明显区别,故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为:取1g RB200及五氯化磷(PCL5)2g放乳钵中研磨5min(在毒气操作橱中),加 10ml无水丙酮,放置5min,随时搅拌,过滤,用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液(0.5mol/L,pH9.5)稀释,逐滴加入0.1ml RB200溶液,随加随搅拌,在0-4℃继续搅拌 12-18h。
(3) TMRITC标记 TMRITC为紫红色粉末,性能比较稳定,分子量为443,最大吸收光谱为550nm,呈橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标记法相同,只是所加色素量为蛋白质量的1/30-1/40,结合时间持续16-18h。
(4) 影响标记的主要因素 温度、时间、酸碱度和标记量4个因素。温度低,标记时间长,温度高,标记时间应短。FITC0-4℃以6-12h为宜,20-25℃以1-2h为宜,37℃30-45min为宜。pH低时,标记较慢,pH值偏高(大于10),抗体易变性,pH值9.0-9.5最为适宜。抗体蛋白含量低,标记慢,以每毫升含20-25mg蛋白为宜。至于标记方法,各有特点,但均不能去除非特异荧光染色因素。透析法适用于小体积的标记。
3.标记抗体的纯化 抗体标记以后,应立即进行纯化处理,以消除或降低非特异性染色和特异交叉染色。其步骤如下:
标记抗体溶液
↓透析或凝胶过滤
去除游离荧光色素
(粗制荧光抗体)
↓DEAE-纤维素层析
去除过度标记的蛋白分子
(精制荧光抗体)
↓抗原交叉吸收或组织制剂吸收
去除特异交叉反应的标记杭体
(免疫纯荧光抗体)
根据免疫荧光试剂的具体用途,纯化的方法可以不同,并不是每一种荧光试剂都须经过以上全部过程。对于某些细菌诊断试剂,只要除去游离荧光素就可以,检测病毒抗原的荧光抗体一般要求下述处理:
(1) 游离荧光素的去除 去除标记过程中未与蛋白质结合的游离荧光素,是纯化标记试剂的最基本要求,不经过这一步处理,任何免疫荧光试剂都不能应用。
① 半透膜透析法 利用荧光色素分子可以通过半透膜,而蛋白分子则因分子量大不能通过的原理,逐步将游离色素除去。先将标记好的抗体溶液装于透析袋或玻璃纸袋内,注意使液面上留有一定空间,扎紧袋口,先用流动自来水透析5 min,再转入PBS ( 0.01mol/L,pH7.2)或生理盐水中继续透析,外液量至少大于内液量100倍,透析应在低温(0-4℃)下进行,每天换液3-4次,整个透析时间约需1周左右,时间过长容易造成蛋白质变性,影响荧光抗体的质量。取透析液(外液)以紫外线灯检查,若无荧光出现,即可停止透析。
② 凝胶过滤法 利用荧光色素分子和蛋白质分子量的悬殊差别,通过分子筛除去游离荧光素,一般1h以内即能完成操作,但最好与透析法结合进行。先将标记抗体溶液透析4 h,除去大部分游离荧光素和其他小分子物质以后,再进行凝胶过滤,这样有利于保护凝胶柱,延长使用时间。凝胶柱sephadex G25和G50装好后,以洗脱液(0.001mol/L或0.005mol/L PBS,pH7.0-7.2)平衡,然后加入样品,样品与柱床容积的比例1:2以下皆可。样品全部进入柱床后,即可进行洗脱。应用此法可使游离荧光素完全除去,同时荧光抗体可以100%回收。
(2) 过度标记的蛋白分子的去除 去除游离荧光素后,结合物中存在的未标记的和过度标记的蛋白质,是降低染色效价和出现非特异性染色的主要因素。常用的方法是DEAE-纤维素或DEAD-葡聚糖凝胶层析,结合物通过层析柱后,过度标记的部分(易出现非特异性)被吸附,过低标记的或未标记的部分(易降低敏感性)自由流出,从而可以得到荧光素与蛋白质结合比最适的部分。
DEAD-纤维柱用PBS平衡后,柱上端放一大小合适的滤纸片,打开下口,调解流速至每分钟10-20滴左右,待柱上液面剩一薄层PBS时,用吸管滴加标记样品,样品进入柱床尚离一薄层时,用适量PBS冲洗管壁,然后用大量0.01mol/L,pH7.2PBS洗脱,用20%磺基水杨酸液试测洗脱液。待蛋白出现阳性反应时即可收集,蛋白反应阴转时停止收集,该洗脱液即为纯化的标记抗体。
(3) 特异交叉或额外应用性标记抗体的去除 去除特异交叉或额外应用标记抗体,常用组织粉末吸收法,最常用的是肝粉,这一步处理对标记的抗体来说,损失是很大的,一般可省去这一步。
4.标记抗体的鉴定 经过以上各种程序所获得的精制荧光抗体,使用前须做特异性测定、敏感性鉴定以及纯度测定后,才可正式用于荧光抗体染色。
(三) 荧光抗体染色
1.标本的固定 在荧光抗体试验中,染色标本的固定是个很重要的步聚。通过固定,不仅要使标记的抗体易于接近抗原,从而发生反应,而且要求标本中的抗原的活性不受损失,同时还要保护其自然形态和位置。因此,根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同,相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇,其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定,组织培养标本主要用丙酮固定。固定液的浓度:丙酮为100%,乙醇为100%或95%,甲醛为10%,甲醇为100% 。固定的温度和时间变化很大,温度从-70℃至37℃都有应用,时间一般在10-30min。
2.染色
(1) 直接染色法
① 于标本片上滴加适当稀释的荧光抗体,置湿盒内,37℃感作30min后取出。
② 先以pH7.2PBS冲洗,继以自来水冲洗5min左右,最后以蒸馏水冲洗,自然干燥或吹干。
③ 滴加缓冲甘油封片(无荧光甘油9份,pH7.2PBS 1份)镜检。
④ 对照的设立
本自发荧光对照:已知抗原标本加1-2滴PBS或不加,应无荧光出现。
抗原对照:已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色,应无荧光。
阻抑试验:标本滴加同种未标记抗体感作30min后,再加标记抗体,镜检应无荧光现象。
种属抗原染色:标记抗体与种属抗原标本染色,应无荧光出现。
阳性对照:标记抗体与已知抗原染色,应呈强荧光反应。对照染色可根据条件适当选择。
(2) 间接法染色
① 标本经固定后,于被检标本上滴加已知未标记的抗体(或抗原)置湿盒37℃感作30min。
② 先以pH7.2PBS冲洗,然后浸泡于三缸PBS中,每缸3min并注意振荡。
③ 弃掉PBS,用吸水纸吸干。
④ 滴加相应的抗球蛋白荧光抗体,置湿盒37℃感作30min。
⑤ 以上以PBS浸洗3次,最后用蒸馏水洗1次,缓冲甘油封片后镜检。
⑥ 对照染色
1) 被检标本加抗球蛋白荧光抗体,应无荧光出现。
2) 标本先以相应正常动物的血清处理30min,水洗后再以抗球蛋白抗体染色,应无荧光出现。
3) 阳性对照 已知阳性标本加相应的特异性免疫血清,然后再以抗球蛋白荧光抗体染色,应出现特异的明亮荧光。

参考文献
[1] 殷震、刘景华、动物病毒学,科学出版社,1985
[2] 刘玉斌、敬仕金,动物免疫学实验技术,吉林科学技术出版社,1989
[3] 徐宜为,免疫检测技术,科学出版社,1991
[4] 杜平,医用实验病毒学,人民军医出版社,1995
[5] 北京医学院微生物学教研室,实验免疫,人民卫生出版社,1980
[6] 南京农业大学,家畜传染病学(第二版),农业出版社,1986
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免疫酶技术

免疫酶技术是继免疫荧光技术和放射免疫测定技术之后发展起来的又一种免疫标记技术。
(一) 原理 免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合,以酶作标记物,酶对底物具有高效催化作用的原理而建立的。酶与抗体或抗原结合,既不改变抗体或抗原的免疫反应的特异性能,也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体相结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复全物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解,使供氢体氧化而成有色物质。有色物质的出现,客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量,从而达到定性或定量的目的。
(二) 分类 免疫酶技术在方法上分为两类,一类用于组织细胞中的抗原或抗体成份检测出和定位,称为免疫酶组织化学法或免疫酶染色法; 另一类用于检测液体中可溶性抗原或抗体成分,称为免疫酶测定法。
1.免疫酶染色法 标本制备后,先将内源酶抑制,然后便可进行免疫酶染色检查。其基本原理和方法与荧光抗体法相同,只是以酶代替荧光素作为标记物,并以底物产生有色产物为标志。免疫过氧化物酶试验是免疫酶染色法中最常用的一种。常规免疫酶染色法可分为直接和间接两种方法。
(1) 直接法 用酶标记特异性抗体,直接检测微生物或其抗原。在含有微生物或其抗原的标本固定后,消除其中的内源性酶,用酶作标记的抗体直接处理,使标本中的抗原与酶标抗体相结合,然后加底物显色,进行镜检。
(2) 间接法 将含有微生物或其抗原的组织或细胞标本,用特异性抗体处理,使抗原抗体结合,洗涤清除未结合的部分,再用酶标记的抗体进行处理,使其形成抗原-抗体-酶标记抗体复合物理学,最后滴加底物显色,进行镜检。
间接法虽然多一步骤,但比直接法特异性强,使用范围广。因为只要用一种酶标记一种动物的球蛋白抗体,就可以检测该种动物的任何一种抗体。此外,酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或微生物素与亲合素系统等代替,亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时,在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性。免疫酶染色法已在动物检疫中广泛应用。
2.免疫酶测定法 免疫酶测定法分固相免疫酶测定法和均项免疫酶测定法两类。
固相免疫酶测定方法是需要用固相载体,以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上,制成免疫吸附剂,随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验(ELISA)是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种(详见酶联免疫吸附试验一节)。

均相免疫酶测定法不需将游离的和结合的酶标记物分离,也不需载体,直接从溶液中测定结果。本法主要用于激素、抗生素等小分子半抗原的检测,微生物学上不常应用。本节将重点介绍免疫酶染色法。
(三) 酶结合物的制备与纯化在免疫酶技术中,能否制备高质量的酶结合物是试验成败的关键。为获得高质量的酶标记抗体,首先要有纯度高、活性强的酶和抗体。高质量的抗体可通过提取纯化获得。目前,应用最广泛的是辣根过氧化物酶。其次有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D半乳糖苷酶。用于抗体和抗原标记的酶应无毒性、分子量小、特异性和纯度高、活性强、稳定,且易结合抗体或抗原而不明显影响彼此的活性。
辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP),是从植物辣根中提取的一种过氧化物酶。它是由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉构成的一种庶糖蛋白,含有多种同功酶,分子量约为 40 000,等电点在pH 5.5-9.0之间。该酶在PH 5-10,50℃以下最稳定,在稀溶液中易失活,在-80℃保存最佳。氰化物、重氮化合物、氟化物和硫化物等对之的抑制作用。由于铁卟啉为HRP的活性基团,在403nm波长下呈现最大的光吸收,而与酶反应无关的其他蛋白质,在75nm波长下出现一个光吸收峰,因此可用其光密度的比值来表示酶的纯度。通常用德文(Reinhoit Zahl)的缩写字母RZ表示。即酶的纯度RZ= OD403nm/OD 275nm,RZ越大,酶的纯度越高;RZ越小,酶的纯度越低。高质量酶的RZ应该大于3,RZ值在2.5以上方可使用。
酶的制剂的另一个质量标准是活性单位(U/mg),标记用的HRP活性应达到达250 U/mg以上。酶的活性是以红培酚(purpurogailn) 单位表示的,即以焦性没食子酸辣(pyrogallol) 为供氢体,在pH6.0,20℃时20s内形成1μg红培酚为一个单位。
酶标记抗体的制备方法很多,目前应用最广泛的有戊二醛法和过碘酸钠法。
1.改良过碘酸钠法 将5mgHRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新配制的0.06mol/LNaIO4水溶液0.5ml,混匀置冰箱30min,取出加入0.16mol/L乙醇水溶液0.5ml,室温放置30min后加入含5mg纯化抗体的水溶液(或PBS)1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L,pH9.5碳酸盐缓冲液缓慢慢搅拌透析6h(或过夜)使之结合,然后加NaBH4溶液(5mg/ml) 0.2ml,置冰箱2h。将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵,冰箱放置30min;离心,将所得沉淀物溶于少许0.02 mol/L pH7.4PBS中,并对之透析过夜。次日再离心除去不溶物,即得酶-抗体结合物,加0.02 mol/L pH7.4PBS至5ml,测定后,冷冻干燥或低温保存。
2.戊二醛一步法 在1.0ml含5mg免疫球蛋白的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液(PB)中,加入12ml HRP。缓慢搅拌并逐滴加入1%戊二醛溶液0.05ml 。室温下继续搅拌2h或旋转3 h,然后搅拌并滴加等量100%饱和硫酸铵,于4℃冰箱静止60min,3 000r/min离心沉淀30min。将沉淀物用50%饱和度硫酸铵洗涤2次,再将沉淀物溶于少量0.02mol/L pH7.4PBS中,再于 4℃冰箱中透析24h,中间换液3次,最后测OD403nm和OD256nm,计算出结合物的酶含量,IgG量以及其克分子比值。
3.戊二醛二步法 取HRP5mg溶于pH9.5、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(CBS)中,滴入25%戊二醛0.1ml混匀,37℃水浴2h。取出后加220g/L NaCl0.1ml,充分混匀后置4℃冰箱内10min预冷。将遇冷至4℃的无水乙醇2.4ml,于塑料离心管内颠倒混匀后立即1 000r/min离心10min,弃其上清液,将沉淀用冷至4℃的80%乙醇洗1次,将离心管倒置,使乙醇流尽(必要时用滤纸拭去)。用PBS0.5ml溶解沉淀物,加入待标记的抗体溶液0.5ml(含IgG5-10mg)混合后4℃过夜,加入适量中性甘油后分装,-20℃保存。
4.结合物中HRP与抗体量的测定 用分光光度计上分别于280nm和403nm波长测定酶标结合物的光密度(OD),并计算出OD403与OD280之比值以及HRP与抗体的摩尔比。
结合物中HRP浓度(mg/ml)=OD280×0.4
结合物中IgG浓度(mg/ml)=(OD280-OD403)×0.3×0.62
酶/抗体摩尔比=(HRP浓度/IgG浓度)×4
5.结合物稀释度的测定 用酶结合物中与抗体相应的抗原直接包被聚苯乙烯反应板,采用ELISA直接法测定酶结合物效价,通常本法制备的酶结合物作1:10000稀释时,其OD490仍在1.0以上。
(四) 免疫酶染色法的操作程序 以间接为例:
1.染色标本制备 用于免疫酶染色的标本有组织切片(冰冻切片、石蜡切片)、组织乳剂涂片、组织压印片以及组织培养单层细胞标本等。这些标本的制备方法与免疫荧光技术相同。
2.固定 标本制备后,应选用适当的固定剂进行固定。选用的固定剂应既不影响抗原的活性,又不妨碍杭体的进入,有利于抗原和抗体的结合。微生物抗原的固定剂一般应用甲醇、乙醇和丙酮,以冷条件下的固定为宜,固定时间为10-15min。
3.消除内源酶 用酶结合物作细胞内抗原定位时,由于有些组织和细胞内含有内源性过氧化物酶。可与标记的过氧化物酶在显色反应上发生混淆,因此必须在滴加酶结合物之前,消除内源性酶。即可用0.3%-3%的过氧化氢室温处理标本15-30min,用0.1%苯肼37℃作用 1h,或用0.074%盐酸乙醇液(100ml乙醇中含0.2ml浓盐酸)。室温处理15min,再移入 PBS和生理盐水中处理15min,还可用1%-3%H2O2甲醇处理单层细胞标本和组织乳剂涂片标本,同时起到固定和消除内源酶的作用。
4.消除背景染色 在免疫酶染色法中,消除背景染色是一个关键问题。背景染色有时是特异的,如病变组织的炎性浸润、组织坏死和自溶等,都可引起抗原扩散和移位,造成背景染色。然而,大量的是非特异性背景染色,主要是由于组织成分对免疫球蛋白的非特异粘附所致,这在第一抗体最易发生。可用与第一抗体不同种类的正常动物血清作预处理,最好用来自与酶标记等二抗体同种动物的血清做预处理。如是切片标本可以3% H2O2作用后,再用 10%卵白蛋白作用30min,还可用保温液即0.05%吐温-20和含0.1牛血清白蛋白(BSA)的 PBS对细胞标本进行预处理以达到消除背景染色的目的。
5.感作 滴加最适浓度的抗血清,在湿盒内37℃感作30min,使其形成抗原抗体复合物。
6.标记 用pH7.4的PBS充分泡洗标本后,滴加最适浓度的酶标记抗IgG抗体使其形成抗原-抗体-抗IgC抗体-酶复合物。
7.加底物 用PBS充分泡洗后,加3,3一二氨基联苯二胺(DAB)- H2O2底物溶液,避光显色15-30min。
8.检查 冲洗后肉眼观察或借助普通光学显微镜检查,抗原所在部位呈现棕黄色。
在上述染色过程中,第一抗体和酶标记第二抗体的最佳使用浓度应以棋盘滴定预先选择,不宜过低或过高,过低会影响检出敏感性,过高则呈现非特异性染色。
(五) 试剂及其配制
1.过碘酸钠法制备酶标记抗体所用试剂的配制
(1) 0.16mol/L 乙醇溶液

乙二醇
0.1ml

蒸馏水
加至10ml
(2) 0.06ml/L过碘酸钠溶液(新鲜配制)

NaIO4
0.128g

蒸馏水
加至10ml
(3) 0.1mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液

0.1mol/L Na2CO2
30ml

0.1mol/L NaHCO3
75ml
2.戊二醛法制备酶标抗体所用试剂的配制
(1) 0.05mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液 (CBS)

NaHCO3
2.94g

Na2CO3
1.59g

蒸馏水
加至1 000ml
(2) 220g/L NaCl

NaCl
22g

蒸馏水
加至100ml
3.免疫酶染色法中所用试剂的配制
(1) pH7.4PBS溶液

NaCl
8.0g

KH2PO4
0.2g

Na2HPO4?12H2O
2.9g

Kcl
0.2g

蒸馏水
加至1 000ml
(2) 保温液 于pH7.4PBS中吐温-20,使其浓度为0.5%,再加牛血清白蛋白,使其最终浓度为0.1% 即成。
(3) 0.05mol/L pH7.6Tris-HCl缓冲液

0.2mol/L Tris溶液
25ml

0.1mol/L HCl溶液
40ml

蒸馏水
加至100ml
(4) 3,3-二氨基联苯胺-H2O2溶液(DAB-H2O2)
取DAB50 100mg溶于0.05mol/L pH7.6 Tris-HCl缓冲液100ml中,过滤,避光保存,染色前加30%H2O2,最终浓度为0.03% 。

参考文献
[1] 殷震等,动物病毒学,科学出版社,1985
[2] 北京医学院微生物学孝研组,实验免疫学,人民卫生出版社,1980
[3] 刘玉斌等,动物免疫学实验技术,吉林科学技术出版社,1989
[4] 武建国,实用临床免疫学检验,江苏科学出版社,1989
[5] 李成文,现代免疫化学技术,上海科学技术出片社,1992
[6] 徐宜为,免疫检测技术,科学出版社,1991
[7] 杜平,医用实验病毒学,人民军医出版社,1985
[8] 蔡宝祥等,动物传染病诊断学,1993
[9] 蒋成淦,酶免疫测定法,人民卫生出版社,1984
biogoogle 生物秀探花 发表于 2008-9-16 20:57:46 | 显示全部楼层
中和试验

物受到病毒感染后,体内产生特异性中和抗体,并与相应的病毒粒子呈现特异性结合,因而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。中和试验 (Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础,以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,来判定免疫血清中和病毒的能力。
中和试验常用的有两种方法:一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合,另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合;然后把血清-病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后,接种于敏感细胞、鸡胚或动物,测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡,说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量,故中和试验可应用于:
1.病毒株的种型鉴定:中和试验具有较高的特异性,利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清,即可测知相应血清或病毒的型,所以,中和试验不但可以定属而且可以定型。
2.测定血清抗体效价:中和抗体出现于病毒感染的较早期,在体内的维持时间较长。动物体内中和抗体水平的高低,可显示动物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性。
毒素和抗毒素亦可进行中和试验,其方法与病毒中和试验基本相同。
用组织细胞进行中和试验,有常量法和微量法两种,因微量法简便,结果易于判定,适于作大批量试验,所以近来得到了广泛的应用。
(一) 定血清-稀释病毒法(病毒中和试验)
1.病毒毒价的测定 毒价单位:衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD),即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系,在越接近100%死亡时,对剂量的递增越不敏感。而一般在死亡率越接近50%时,对剂量的变化越敏感,故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位,即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。用鸡胚测定时,毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量 (EID50)。用细胞培养测定时,用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时,则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。
测定方法:将接种病毒,并已发病濒死的小鼠,无菌法取脑组织,称重、加稀释液充分研磨,配制成10-1悬液,3 000r/min离心20分钟,取上清液,以10倍递次稀释成10-1、10-2、10-3 ……10-9,每个稀释度分别接种5只小鼠,每只脑内注射0.03ml,逐日观察记录各组的死亡数。
表2-24 LD50的计算(接种剂量为0.03ml)

病毒稀

释度

接种

鼠数

活鼠数

死鼠数

积累总计

死亡比

死亡率

(%)

活鼠

死亡

10-4

5

0

5

0

15

15/15

100

10-5

5

0

5

0

10

10/10

100

10-6

5

1

4

1

5

5/6

83

10-7

5

4

1

5

1

1/6

17

10-8

5

5

0

10

0

0/10

0

10-9

5

5

0

15

0

0/15

0

LD50的计算:按Reed和Muench氏法计算。
          高于50%的死亡分数-50%                83%-50%
距离比例= ──────────────────── = ────── = 0.5
          高于50%的死亡百分数-低于50%的死亡百分数   83%-17%
LD50的对数=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%病毒稀释度的对数-6,距离比例为0.5,称释系数的对数为-1。代入上式:
LgLD=-6+0.5×(-1)=-6.5
则LD50=10-6.5,0.03ml,即该病毒作10-6.5稀释,接种0.03ml能使半数小鼠发生死亡。
注意:稀释血清法中和试验,计算TCID50或LD50,MID50时,计算公式应改为:TCID50的对数=高于50%血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数。
如按Karber氏法计算,其公式为:
IgLD50(或TCID50)=L+d(S-0.5)
L为病毒最低稀释度的对数,d为组距,即稀释系数,S为死亡比值的和。本例L=-4,d=-1,S=1+1+5/6+1/6=3
IgLD50=-4+(-1)×(3-0.5)
=-6.5
则       LD50=10-6.5,0.03ml
注意:用本法计算稀释血清中和试验中和效价时,S应为保护比值之和。
(2)EID50的测定(以新城疫病毒为例) 将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度,分别接种9-10日龄鸡胚尿囊腔,鸡胚必须来自健康母鸡,并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.2ml,每个稀释度接种6只鸡胚为一组,以石蜡封口,置37-38℃培养,每天照蛋,24h之内死亡的鸡胚弃掉,24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5天,取尿囊液作血球凝集试验,出现血凝者判阳性,记录结果,按上述方法计算 EID50。
(3) TCID50的测定(以致细胞病变病毒为例) 取新鲜病毒悬液,以10倍递次稀释成不同稀释度,每个稀释度分别接种经Hanks液洗3次的组织细胞管,每管细胞接种0.2ml,每个稀释度接种4只细胞管,接种病毒后的细胞管放在细胞盘内,细胞层一侧在下,使病毒与细胞充分接触,放置37℃吸附1h,加入维持液,置37℃培养,逐日观察并记录细胞病毒管数,按上述方法计算TCID50。
2.中和试验
(1) 病毒稀释度的选择 选择病毒稀释度范围,要根据毒价测定的结果而定,如病毒的毒价为10-6,则试验组选用10-2-10-8对照组选用10-4-10-8其原则是:最高稀释度要求动物全存活(或无细胞病变),最低稀释度动物全死亡(或均出现细胞病变)。
(2)血清处理 用于试验的所有血清在用前须作56℃30min加温灭活。但来自不同动物的血清,灭活的温度和时间也是不同的。
(3)病毒的稀释 按选定的病毒稀释度范围,将病毒液作10倍递次稀释,使之成为所需要的稀释度。
(4)感作 将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内,第一排每管加入与病毒等量的免疫(或被检)血清作为试验组;第二排每管加入与免疫(或被检)血清同种的正常阴性血清作为对照组;充分摇匀后放37℃感作12h。
(5) 接种 按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物(或鸡胚、组织细胞)。观察持续时间,根据病毒和接种途径而定。
(6)中和指数据计算 物按Reed和Muench两氏法(或Karber)法分别计算试验组和对照组的LD50(或EID50、TCID50)
            试验级LD50 (EID50、TCID50)
中和指数 = ──────────────────
            对照组LD50 (EID50、TCID50)
假如试验组LD50为10-2.2,对照组LD50为10-5.6。则中和指数为103.3,103.3=1 995,也就是说该待检血清中和病毒的能力比正常血清大1995倍。
(7)结果判定 固定血清―稀释病毒法进行中和试验,当中和指数大于50,表示补检血清中有中和抗体;中和指数在10-50为可疑;若中和指数小于10为无中和抗体存在。
(二) 固定病毒-稀释血清法(血清中和试验)
1.病毒毒价的测定(微量法)
(1) 病毒的制备 将病毒接种于单层细胞,37℃吸附1h后加入维持液,置温箱培养;逐日观察,待细胞病变(CPE)达75%以上,收获病毒悬液冻融或超声波处理,以3 000r/min离心10min,取上清液,定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用,选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。
(2) 病毒毒价测定 取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶,将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1,10-2,10-11……,每孔病毒悬液量为50μl,每个稀释度作8孔,每孔加入100细胞悬液,每块板的最后一行设8孔细胞对照,制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5%CO2温箱37℃培养,从48-14h逐日观察细胞病变,记录结果。
按Reed和Muench两氏法计算TCID50。
              56%-50%
距离比例 = ────────
              56%-33%
本例高于50%病毒稀释度的对数为-6,距离比例为0.26,稀释系数的对数为-1。
表2-25
TCID50计算
(接种剂量50μl)

病毒稀释度

接种数

CPE数

无CPE数

累 计

CPE率

百分数(%)

CPE

无CPE

10-2

8

8

0

39

0

39/39

100

10-3

8

8

0

31

0

31/31

100

10-4

8

7

1

23

1

23/24

96

10-5

8

5

3

15

4

15/19

79

10-6

8

4

4

10

8

10/18

56

10-7

8

4

4

6

12

6/18

33

10-8

8

2

6

2

18

2/20

10

10-9

8

0

8

0

26

0/26

0

IgTCID50 = -6+0.26×(-1)
= -6.3
则TCID50=10-6.3,50即病毒作10-6.3稀释,每孔接种50μl,可使半数组织细胞管发生病变。
2.中和试验
(1) 血清的处理 动物血清中,含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用,如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素,用于中和试验的血清须经加热灭活处理。各种不同来源的血清,须采用不同温度处理,猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃;水牛、狗及地鼠血清为62℃;马兔血清为65℃;人和豚鼠血清为56℃。加热时间为20-30min,60℃以上加热时,为防止蛋白质凝固,应先以生理盐水作适当稀释。
(2) 稀释血清 取已灭活处理的血清,在96孔微量细胞培养板上,用稀释液作一系列倍比稀释,使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64,每孔含量为50μl,每个稀释度作4孔。
(3) 病毒 取-70℃冰箱保存的病毒液,按经测定的毒价作200TCID50稀释(与等量血清混合,其毒价为100TCID50)。如本例病毒价为10-6.3,50μl。所以应将病毒作2×10-4.3稀释。
(4) 感作 每孔加入50μl病毒液,封好盖,置于37℃温箱中和1h。
病毒与血清混合,0℃下,不发生中反应,4℃以上中和反应即可发生。常规采用37℃作用1h,一般病毒都可发生充分的中和反应。但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作,根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。
(5) 加入细胞悬液 在制备细胞悬液时,其浓度以在24h内长满单层为度:血清病毒中和1h后取出,每孔加入100μl细胞悬液。置5%CO2 37℃温箱培养,自培养48h开始逐日观察记录,14h终判。
由于各种病毒引起细胞病变时间不同,终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。
(6) 设立对照 为保证试验结果的准确性,每次试验都必须设置下列对照,特别是在初次进行该种病毒的中和试验时,尤为重要。
阳性和阴性血清对照:阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验,阳性血清对照应不出现细胞病变,而阴性血清对照应出现细胞病变。
病毒回归试验:每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆,先将病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀释,每个稀释度作4孔,每孔加50μl。然后每孔100μl细胞悬液。 0.1TCID TCID50应不引起细胞病变,而且100TCID TCID50必须引起细胞病变,否则该试验不能成立。
血清毒性对照相:为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用,设立被检血清毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清(相当于中和试验中被检血清的最低稀释度)。
正常细胞对照相:即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征,为避免培养板本身引起试验误差,应在每块板上都设立这一对照。
(7) 结果判定和计算 当病毒回归试验,阳性、阴性、正常细胞对照相,血清毒性对照全部成立时,才能进行判定,被检血清孔出现100%CPE判为阴性,50%以上细胞出现保护者为阳性;固定病毒稀释血清中和试验的结果计算,是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度,该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。
用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果,如表2-26
          80%-50%
距离比例=──────=0.5
          80%-20%
Ig TCID50=高于50%血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数
Ig TCID50=-1.5-0.5×(-0.3)=-1.35
表2-26 固定病毒-稀释血清法中和抗体效价计算

血清稀释

CPE数

总孔数

CPE数

无CPE数

积累

CPE比率

百分数

CPE

无CPE

1:4(10-0.6)
0/4

0

4

0

12

0/12

0

1:8(10-0.9)
0/4

0

4

0

8

0/8

0

1:16(101.2)
1/4

1

3

1

4

1/5

20

1:32(10-1.5)
3/4

3

1

4

1

4/5

80

1:64(101.8)
4/4

4

0

8

0

8/8

100

则TCID50=10-1.36,50μl
因10-1.35=1/22,即1:22的血清可保护50%细胞不产生病变,1:22就是该份血清的中和抗体效价。
影响中和试验的因素:
(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键,毒价过高易出现假阴性能,过低会出现假阳性。在微量血清中和试验中,一般使用100-500 TCID50。
(2) 用于试验的阳性血清规戒律,必须是用标准病毒接种易感动物制备的。
(3) 细胞量度的多少与试验有密切关系,细胞量过大或过小易造成判断上的错误,一般以在24h,内形成单层为宜。
(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。
biogoogle 生物秀探花 发表于 2008-9-16 20:58:58 | 显示全部楼层
酶联免疫吸附试验

自从Engvall和Perlman(1971)首次报道建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA)以来,由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用 。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐,但随着方法的不断改进、材料的不断更新,尤其是采用基因工程方法制备包被抗原,采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验,都大大提高了ELISA的特异性,加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用,使ELISA更为简便实用和标准化,从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面,ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
(一) 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
(二) 用于标记的酶 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室温下稳定;反应产物易于显现;能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP应用最广。
1.辣根过氧化物酶(HRP) 过氧化物酶广泛分布于植物中,辣根中含量最高,从辣根中提取的称辣根过氧化物酶(HRP),是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白(含糖量18%),分子量约40 000,约由300个氨基酸组成,等电点为pH 3-9,催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示:RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上,最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶,非酶蛋白约占 75%,不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢,催化反应时的供氢体有几种:(1)邻苯二胺(OPD),产物为橙色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼观察判别,容易被浓硫酸终止反应,颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种;(2)联大茴香胺(OD),产物为橘黄色,最大吸收值在400nm,颜色较稳定;(3)5-氨基水杨酸(5-AS):产物为深棕色,最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性较差;(4)邻联甲苯胺(OT)产物为蓝色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不稳定,不耐酸,但反应快,颜色明显。
2.碱性磷酸酶 系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取,由多个同功酶组成。它们的底物种类很多,常用者为硝基苯磷酸盐,廉价无毒性。酶解产物呈黄色,可溶,最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中,37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
(三) 抗体的酶标记方法及标记效果测定
1.标记方法 良好的酶结合物取决于两个条件:即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要,因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中,抗体的活性有所降低,故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白,最好使用亲和层析提纯的抗体,可提高敏感性,而且可稀释使用,减少非特异性吸附。
酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为:将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。
2.酶标抗体标记效果测定:测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
(1) 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法,使抗原与抗体形成沉淀线,经PBS漂洗1天,再以蒸馏水浸泡1小时,将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色,如果出现应有的颜色反应,再用生理盐水浸泡,颜色仍然不褪,表示结合物既有酶的活性,也有抗体活性。良好的结合物在显色后,琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定,此法不仅可以测定标记效果,还可以确定酶标抗体的使用浓度。
(2) 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定,然后按下列公式计算:
酶量(mg/ml)=OD403×0.42
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量,按下列公式计算:
IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62
已知酶量和IgG量后,即可计算出标记抗体的摩尔(mol)比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4
结合物中酶总量=HRP(mg/ml)×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般,为500(g/ml时效果较好,达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠,所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般,1.0时效果较好,1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般,为9%-10%较好,达30%以上时最好。
(四) ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。
1.间接ELISA 本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例,间接ELISA的操作程序如下。
(1) 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;
③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
④ 加底物液  → 37℃ 30分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值,并计算出P/N比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下,如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待检血清的OD值≥0.4,则判为阳性,否则判为阴性。
2.双抗体夹心ELISA 本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
④ 加底物液  → 37℃ 15分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
3.双夹心ELISA 此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种抗体,还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为:
① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。
4.竞争ELISA 此法主要用于测定小分子抗原及半抗原,其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为:
① 抗体包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
④ 用ELISA检测仪测定OD值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定,如果待检溶液中抗原越多,被结合的标记抗原的量就越少,有色产物就减少,这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记,而且因为抗原的结构不同,还需应用不同的结合方法。此外,试验中应用酶标抗原的量较多。
5.阻断ELISA 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序:
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
6.抗体捕捉ELISA 本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期,所以检测出IgM,则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种,其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性,该方法的主要程序为:
① 用抗u链(抗IgM重链)抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜,洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时,洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
7.斑点ELISA(Dot-ELISA) 与常规的微量板ELISA比较,Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点,而且结果可长期保存;但其也有不足,主要是在结果判定上比较主观,特异性不够高等。该方法的主要操作程序为:
(1) 载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后,稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中,置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40-53个样品,每个压圈可加抗原液1-20μl。
(2) 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中,37℃感作15-30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被检血清 可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置于微量板孔中,再加入一定量适度稀释的待检血清,37℃反应一定时间,用洗涤液洗三次,每次1-3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶标抗体,37℃反应一定时间后,用洗涤液洗三次。
(5) 显色 加入新鲜配制的底物液,37℃反应一定时间后,去掉底物液,加蒸馏水洗涤终止反应。
(6) 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照,膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应,否则为阴性反应。
8.布ELISA(C-ELISA) C-ELISA(Cloth-ELISA)是加拿大学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布(Hydrophobic Polyester Cloth)即涤纶布为固相载体,这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大,可为免疫反应提供较大的表面积,提高反应的敏感性,且容易洗涤,不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似,只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例,C-ELISA的主要程序为:
(1)
首先把抗布氏杆菌的血清包被(吸附)在聚脂布上,并经洗涤及封闭;
(2)
加被检样品并于室温下感作30分钟,然后洗5次;
(3) 加酶标记的抗布氏杆菌抗体,于室温下感作30分钟,然后洗涤5次;
(4) 加入底物液显色;
(5) 测定OD值。

参考文献
[1]牛新林等:上海免疫学杂志,11(6):360-362,1991。
[2]王桂枝等:中国兽医杂志,20(3):3-5,1994。
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[10]阚保东:中国兽医杂志,18(10):40-42,1992。
biogoogle 生物秀探花 发表于 2008-9-16 21:00:36 | 显示全部楼层
红细胞凝集试验

(一) 血凝和血凝抑制试验
某此病毒或病毒的血凝素,能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集,这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination,HA),也称直接血凝反应,当病毒的悬液中先加入特异性抗体,且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素,则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制,称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion,HI)反应,也称血凝抑制反应。
1.原理 血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身,而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。  
病毒的血凝现象大致可以分为3种类型。
(1) 可逆转型 血凝素与病毒颗粒易分开,经超速离心后,病毒颗粒沉淀于管底,血凝素则游离于上清液内。这种血凝素凝集红细胞的现象是可逆的,即被凝集的红细胞释放了吸附于表面的血凝素后,可再与该血凝素发生凝集,如天花、鼠疫等病毒。
(2) 不可逆转型 血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密,不经过特殊处理血凝素不能与病毒颗粒分开,这种病毒引起的红细胞凝集,是不可逆转的。在一定的温度 (37℃)下,病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键的N-乙酰神经氨酸酶,当病毒颗粒从红细胞表面游离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集病毒的能力,如流感病毒、鸡新城疫病毒等。
(3) 凝集条件严格型 有些病毒及其血凝素凝集红细胞的条件很严格,不仅对不同种动物的红细胞有严格的选择,即是对同种动物,由于性别和年龄的不同,对红细胞的凝集性能亦有差异。如流行性乙型脑炎对公鹅的红细胞凝集性能比对经产老龄母鹅的红细胞凝集性能好,除此之处,病毒颗粒或其血凝素凝血时对缓冲液的pH值、温度及盐浓度等的要求均很严格。
2. 材料的准备
(1) 生理盐水
(2) 红细胞保存液 (阿氏液) 的配制 (Acid-citrate-dextrose,简称“ACD”)
氯化钠        4.2g
枸橼酸钠       8.0g
枸橼酸        0.55g
葡萄糖        20.5g
加去离子水至     1000ml
0.075MPa、15min高压后置4℃备用。
(3)
病毒抗原 (血凝素) 稀释液 ( 0.4%pH9.0BABS) 的配制 不同的病毒抗原 (血凝素) 需用不同的稀释液。如鸡新疫血凝素用生理盐水稀释。流行性乙型脑炎血凝素需用0.4% pH9.0BABS稀释液。 pH9.0BABS液的配制:
① 母液的配制

0.5mol/L硼酸溶液:      硼酸30g
加去离子水至        1 000ml
溶解后备用。
1.0mol/L氢氧化钠溶液:
NaOH            40g
加入离子水至        1 000ml
溶解置3天后使用。
1.5mol/L氯化钠溶液:
NaCl            87.7g
加入离子水至        1 000ml
0.075MPa、15min高压后置4℃备用。
② 硼酸氢氧化钠盐溶液 (pH9.0、BHS) 的配制
0.5mol/L硼酸溶液       100ml
1.0mol/L NaOH溶液       24ml
1.5mol/L NaCl溶液       80ml
加去离子水至         1 000ml
充分混匀后调pH值为9.0
③ 使用液(0.4%pH9.0BABS)的配制(现配现用)
pH9.0 BHS液         100ml
牛血清白蛋白         0.4g
充分溶解后使用,现配现用。
(4)
白陶土
(5)
不同pH值的红细胞稀液的配制 虫媒病毒对缓冲pH值的要求都很严格,流行性乙型脑炎病毒要求红细胞在pH5.8-6.6的PBS稀释液内才能凝集。因此,每次试验之前必须用pH 5.8-6.6的PBS的红细胞悬液来试测其最适pH值。
① 母液的配制
甲液:
Na2HPO4?12H2O       35.8g
NaCl            4.4g
加去离子水至        500ml
0.075MPa、15min高压后4℃保存备用。
乙液:
Na2HPO4?2H2O        15.6g
NaCl             4.4g
加去离子水          500ml
0.075MPa、15min高压后4℃ 保存备用。
② 不同pH值的PBS使用液的配制:
pH值

5.8

6.0

6.2

6.4

6.6

甲液(ml)

3.0

12.5

22.0

32.0

45.0

乙液(ml)

97.0

87.5

78.0

68.0

55.0

(6) 红细胞悬液的配制 用5ml一次性无菌注射器,先吸取2ml阿氏液,而后无菌采取所需动物的静 脉血2ml,随即注入盛有10ml左右阿氏液的三角烧瓶 内,迅速摇匀,置4℃过液,次日将血液经无菌纱布过滤至离心管内,经200r/min离心10min,弃上清液,加5-10倍的生理盐水水洗3次,每次2000r/min离心5min,最后一次2000r/min离心10min,弃上清液,沉淀即为可供配制红细胞悬液的血球泥。用最适pH值的PBS液配成0.33%的红细胞悬液。
(7)
血凝素(病毒抗原) 除了痘类病毒的血凝素是与病毒颗粒分开之外,绝大多数的血凝素是与病毒颗粒相关联的。
(8)
25μl的连续加液器和25μl的自动稀释器或不锈钢稀释棒。
(9)
96孔U型微量血凝板及种种规格的吸管、移液器及吸头等实验室常规用具。
3.方法(流行性乙型脑炎) 血凝和血凝抑制试验有常量和微量法,它们除了用量和用具有所不同之外,其他如试验方法、程序、参与要素及其浓度、pH值、作用时间、温度和判定等都一样。常量法各要素用量为0.25ml,在5×10孔的血凝板上进行。微量法各要素用量为25μl,在96孔U型微量血凝板上进行,微量法省时、省料、高效。目前世界各国广泛使用。
微量血凝试验操作:
(1)
血凝素最适pH值的测定
① 取洁净的96孔U型微量血板,在第一排(横)各孔的上测边标上血凝素的不同稀释液,在第一行(纵)各孔的外测边标上红细胞悬液的不同pH值 (5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8)。
② 用25μl的连续加液器,每孔滴入0.4%PH9.0的PBS液25μl。
③ 用移液器在第一行各孔加入血凝素25μl,用自动稀释器或不锈钢稀释棒插入第一行各孔,经充分稀释后,蘸取25μl到第二行各孔,再经充分稀释后蘸取25μl到第三行各孔依次作等量倍比稀释至倒数第二行,并从这一行各孔中弃掉25μl,最后一行各孔不加血凝素、作血球对照。
④ 各孔补加0.4%pH9.0的BABS液25μl,于微型振荡器上振匀20s,置室温 (25℃左右 )或37℃30min。
⑤ 每行各孔分别加入相应pH值的红细胞悬液25μl。每孔总量为75μl,置微型振荡器上振匀20s,置室温(25℃左右 )或37℃30min后观察判断。由表2-20可见,pH6.4是该血凝素所最适pH值。
表2-20
血凝素最适pH值的测定

RBC稀释

液的pH

血凝素稀释度

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

1/2048

RBC对照 

5.8













6.0













6.2













6.4










++



6.6





++








6.8













(2)
血凝素效价的测定 血凝素凝血效价常常受试验条件和试验技术及温度、时间等因素的影响,因此为了正确起见,当血凝素最适pH值确定后还需用最适pH值的红细胞悬液来测定血凝素的效价,能使RBC100%凝集的最高血凝素稀释度为一个血凝单位,如表2-21中一个血凝单位为1:1024,在血凝素抑制试验中用4个血凝单位为1:256。但一般采用50%红细胞凝集作为一个血凝单位,因为50%红细胞凝集的变化比较敏感,所以在血凝抑制试验中用8个凝单位的血凝素即为1:256稀释.




4.微量血凝抑制试验
(1)
被检血清的处理 在正常动物的血清中都存在有非特异性的血凝抑制因子,这就影响了血凝抑制试验的结果。为此,在血凝抑制试验之前,必须将血清经过处理,除去血清非特异性血凝抑制因子,血清(被检、阳性、阴性)处理有白陶土法和冷丙酮法两种:
① 冷丙酮法:被检血清的处理→被检血清0.2ml→加冷丙酮4ml→塞紧振荡55min→离心3000r/min,5min→弃上清液,抽气干燥1小时→加PH9.0BHS2ml→振荡溶解后→ 56℃灭活30min→加8%红血球0.05ml→混匀放37℃水浴30min→ 300r/min离心10min,上清液即为待检血清。
② 白陶土法:被检血清的处理→被检血清0.1ml→加25%白陶土0.5ml→振荡混匀置 37℃1小时→加PH9.0BHS液0.5ml→混匀→6000r/min离心5min→56℃灭活30min→加8%红血球0.05ml→混匀放37℃水浴30min→300r/min离心10min,上清液即为待检血清。
(2)
微量血凝抑制试验的操作
① 取洁净的96孔U型微量血凝板,在第一排 (横) 1-6孔的上侧标上被检血清的稀释度,第7孔为被检血清对照,第8孔为红细胞对照。第一行 (纵) 各孔外侧边标上被检血清号及阴性血清和阳性血清对照。
② 每排的2、3、4、5、6、8各孔加0.4% pH9.0的BABS液25μl。
③ 在每排的1、2、7孔内加入经处理过的与外侧边标记相应的被检血清、阴性血清和阳性血清。
④ 用25μl的自动稀释器或稀释棒,插入第二行各孔,经充分稀释后蘸取25μl至第四行各孔,依次倍比稀释至第六行,并从第六行各孔中蘸取25μl弃掉,第七行各孔作血清对照,第八行作血球对照。
⑤除7、8行各孔之外每孔加入8个单位血凝素25μl。
⑥ 7、8行各孔补加0.4%pH9.0的BABS液25μl,振荡20s,置室温30min。
⑦ 各孔分别加入最适pH的0.33%红细胞悬液25μl,各孔总量为75μl,振荡20s,置室温30min,观察结果.


⑧ 结果判定
#:红细胞在孔底形成小团滴,边缘光滑整齐,周围无凝集。
+++:红细胞在孔底形成小团滴,但边缘不整齐,周围有少量凝集。
++:红细胞在孔底形成环状,周围约有50%凝集。
+:红细胞大部分凝集,但孔底还有红细胞沉淀成滴状,边缘不整齐。
-:红细胞全部凝集,并均匀分布,孔底形成薄膜状。
如果上述各对照组均能成立,则试验结果是可信的。根据凝集程度,确定血凝抑制滴度,以能完全抑制红细胞凝集的最高被检血清稀释度为血凝抑制滴度,被检血清稀释终点“++”时应判为阳性。
5.血凝和凝抑制试验的应用
直接血凝试验主要用于血库中红细胞抗原的分型、病毒抗原的鉴定等。血凝抑制试验主要用来测定血清中抗体的滴度、病毒的鉴定、监测病毒抗原的变异、流行病学的调查、动物群体疫情的监测等。
6.影响血凝和凝抑制试验的因素
(1)
实验室使用的玻璃器材及血凝板均要洁净,血凝板使用完应及时处理,避免残留的酸、碱和沉着的红细胞影响结果。
(2)
红细胞有动物的种类及个体差异,因此同批实验应使用同批红细胞,一旦出现红细胞变色和污染就不得作用。
(3)
病毒及其血凝素如保存不当,或者反复多次冻融也会影响试验结果。
(4)
血清中非特异性抑制因素会影响实验结果,故试验前一定要用白陶土或冷丙酮处理。血清在加温或保存过程中一旦出现沉淀也容易引起非特异性凝集,这可用红细胞吸附或通过离心来除去。
(5)
如滴定双份血清,抗原分析或比较动物群体抗体水平时应安排在同一次试验进行,各参与要素和器具都应使用同一批次,以免材料的不同而影响实验结果。
(6)
判定结果一定要在规定的时间观察,每次试验应在一定的温度下进行,如流感病毒在37℃时会从红细胞表面释放出来,因此,炎热的夏天最好4℃下观察结果。
(7)
试验时加量要准确,才能保证实验结果的正确性和重复性。
(二) 间接血凝试验和反向间接血凝试验
1.原理 凝集反应中抗体球蛋白分子与其特异的抗 原相遇时,在一的条件下,便可形成抗原抗体的复合物,由于这种复合物分子团很小,如果抗原抗体的含量过少时,则不够形成肉眼可的凝集。若设法将抗原结合或吸附到比其体积大千万倍的红细胞表面上,则只要少量的抗体就可以使红细胞通过抗原抗体的特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。这就大大地提高了凝集反应的敏感性。于是人们将红细胞经过鞣酸或其他偶联剂处理后,使得多糖抗原或蛋白质抗原被红细胞表面的受体结合或吸附,这种被抗原致敏的红细胞遇到相应的抗体时,在一定的条件下,由于抗原抗体的特异性结合而间接地带动着红细胞的凝集,这一反应称为间血凝反应。若在抗血清中先加入与致敏血球相同的抗原,在一定的条件下,经过一定时间后再加上这种抗原致敏的红细胞就不再发生红细胞的凝集,即抑制了原有的血凝反应,这种现象称为间接血凝抑制反应。同样,如果用抗体球蛋白致敏红细胞上,也能与相应的抗原在一定的条件下起凝集反应,这称为反向间接血凝试验。当在与致敏红细胞的抗体相应的抗原液中,先加入相应的特异性抗体,在一定的条件下,经过一定的时间后再加入这种抗体致敏的红细胞,由于抗原先和特异性抗体结合,这种抗体致敏的红细胞就不能与抗原起反应,呈现血凝抑制现象,这叫反向凝抑制试验。


一般抗原致敏红细胞比较容易,而用抗体致敏红细胞比较困难,主要原因是抗血清中蛋白质的成分很复杂,其中除了具有抗体活性的免球蛋白之外,还有非抗体活性的免疫球蛋白,这两种免疫球蛋白很难使之分开,而且这两种免疫球蛋白均能同时结合或吸附在红细胞表面,一旦非抗体活性免疫球蛋白在红细胞表面达到一定数量时,致敏的红细胞就不能再与相应的抗原形成可见的凝集。因此,一般实验室均用抗原来致敏红细胞。
2.材料
(1)
红细胞悬液 很多动物的红细胞,如绵羊、家兔、鸡、鸽了、马、猴子及人的O型血都可用来作为间接血凝试验的红细胞载体,实验室多选用绵羊细胞。选择健康的绵羊,无菌自颈静脉采血,并将其注入盛有4倍绵羊血量的阿氏液的三角烧瓶内,不时摇动3-5 min ,置4℃过液,次日将保存在阿氏液内的红细胞液经灭菌纱布过滤后用生理盐水洗3-4次,每次2000r/min离心5min,最后一次2000r/min离心10min,用生理盐水配成0.5%-1%的红细胞悬液,4℃保存,备用期不超过一周。
(2)
红细胞的醛化
① 醛化原则 用新鲜红细胞无论是致敏的或未致敏的保存期都很短,临时致敏也不方便,且不同批次或不同动物个体的差异,造成对系统研究工作前后结果不一,影响诊断,故目前都采用醛化红细胞。醛化的方法随醛类的不同 ( 有甲醛、戊二醛及丙酮醛 ) 而异,但醛化的原则是一的,如加醛之前红细胞必须充分洗涤,除净红细胞表面的血浆蛋白;加醛固定过程中红细胞最终浓度为10%;开始加入醛的浓度不宜过浓;醛化作用温度要低,否则红细胞容易变异;在整个醛化过程中要不时地振摇,使醛类与红细胞充分均匀地接触。目前国内都采用戊二醛,因为戊二醛醛化过程简单,在短时期即可完成,且致敏的效果也比较好。
② 醛化方法 红细胞用0.15mol/L的pH7.2的PBS液配成4%的悬液,在冰浴的条件下加入2.5%的戊二醛,边加边摇,使最终浓度为0.4%(即100ml4%的红细胞悬液内加入16ml2.5%的戊二醛),在4℃固定1h,摇匀后用生理盐水洗涤4-5次,最后用生理盐水配成10%的红细胞悬液。加1:10 000(终浓度) NaN3,4℃保存备用。
③ 再醛化(双醛化法) 在第二步用了生理盐水洗涤单醛化的红细胞后,将红细胞用0.15mol/L的pH 7.2的PBS液配成4%的悬液,再用丙酮醛(最终浓度1.5%)作第二次醛化,4℃固定17h,不断摇晃,洗涤后配成4%的红细胞悬液,加入1:10000(最终浓度)NaN3,4℃保存备用。
(3) 鞣酸处理红细胞 为了进一步提高间接血凝敏感性,经醛化后的红细胞必须再经鞣酸处理,因为鞣酸本身也是一种血凝素,其高浓度时会使红细胞凝集,低浓度时使红细胞处于不稳定状态,故经适当浓度的鞣酸处理后,致敏的红细胞能使实验的敏感性大大提高,其操作如下:
① 称取适量优质鞣酸用PH 7.2的PBS液配成1:20 000的溶液,须现用现配。
② 将4℃保存的醛化红细胞,用生理盐水洗2-3次,并用生理盐水配成2.5%的红细胞悬液,与等量的1:20 000的鞣酸混合,置于37℃水浴10-15min,取出用pH 7.2的PBS液洗一次,再用pH7.2的PBS液配成2.5%的红细胞悬液。
(4) 鞣酸化红细胞的致敏 将抗原(或抗体)结合或吸附于红细胞表面称为致敏,已结合或吸附抗原(或抗体)的红细胞称为致敏红细胞。致敏物质可为糖类或蛋白质。多糖抗原比较容易致敏,可吸附于未经处理的红细胞表面。而蛋白质抗原或抗原体需要有别的成分参与方能致敏红细胞,如常用的鞣酸法、联苯胺法、金属离子法等。
① 致敏红细胞的最适抗原或抗体用量的测定 致敏红细胞的抗原或抗体的用量过低就不能得到血凝的最高效价,而过高亦不能再提高反应的敏感性,因此在正式试验之前都必须试致敏用的抗原抗体的最适用量。方法是将抗原体作倍比稀释,分别致敏红细胞后,再与相应的抗血清或抗原作血凝反应,出现最高血凝效价的最少抗原(或抗体)称为一个致敏单位,正式实验使用两个致敏单位即可。
② 致敏方法 取两个单位的致敏抗原 (或抗体)1mL ,加pH 6.4的PBS液4mL ,再与2.5%鞣化红细胞混合均匀后于37℃作用30min,经2000 r/min离心5min,沉淀的红细胞用含有1%已灭能的健康兔血清的PBS pH7.2液洗涤2次,充分洗 涤游离的抗原或抗体,再用含1%健康兔血清的pH7.2的PBS液配成2%的致敏红细胞悬液,一般病毒抗原致敏的红细胞应立即使用,4℃保存也不超过48小时,为了延长致敏红细胞的保存期,将洗涤后的致敏红细胞用含 4%健康兔血清的PBS pH 7.2液配成10%的致敏红细胞悬液加0.01%的硫柳汞摇匀,分装于灭菌的安瓶,1支1mL,低温真空干燥,冻干以后的致敏红细胞其凝集效价不变,亦无自凝现象,在4-6℃可保存6个月,冻干致敏红细胞使用时,每支加pH7.2的PBS液5mL摇匀后使用。
(5) 兔血清稀释液 取5-7只健康的成年兔,心脏采血,分离血清,所得各血清经检查无菌后混合,56℃灭能30min ,凉后加等量的2%的戊二醛红细胞悬液摇匀,置37℃作用30min之后2000r/min离心15min ,上清液即为2倍稀释的兔血清,分装置后-20℃ 保存,可长期使用,同时,取pH7.2PBS液98mL,加2倍稀释的兔血清2mL,即为1%兔血清的pH7.2PBS稀释液,现用现配。
(6) 器材 微量振荡器,25μl的连续加液器和25μl的移液器等实验室常用器械。
3.方法(猪的支原体肺炎)
(1) 微量血凝板的标记。
① 取洁净的96孔V型血凝板,数量视试验需要。
② 在微量板的第一排(横)各孔上边标上血清的稀释度,最后一孔作致敏的红细胞对照。
③ 在微量板的第一行(纵)各孔的外侧边标上被检血清号及对照用的阴性血清、阳性血清。
(2) 微量间接血凝试验的操作
① 用25μl的连续加液器,每孔加入含1%兔血清pH 7.2PBS稀释液25μl。
② 用25μl的移液器分别吸取25μl的被检血清,阴性血清、阳性血清加入第一行与标记相应的各也内。
③ 用微量自动稀释器或稀释棒, 插入第一行各孔内,经充分稀释后醮取25μl移至第二行的各孔内,再经充分稀释后醮取25μl至第三行各孔内,依次倍比稀释至倒数第二行为止,并从这一行各孔内弃掉25μl。
④ 各孔分别加入1%的致敏红细胞悬液25μl。
⑤ 在微型振荡器上振荡2min ,置室温2h后观察结果。
(3) 结果判定
#:100%红细胞凝集,凝集颗粒均匀地分布在整个孔底,呈薄状。
+++:75%红细胞凝集,孔底红细胞呈滴状,凝集边缘不整齐。
++:50%红细胞凝集,孔底形成环状,周围有凝集颗粒,但不成膜状。
+:25%红细胞凝集,孔底形成一个小团,但小团边缘不整齐,周围有少量凝集。
-:红细胞完全不凝集,红细胞在孔底形成小团 ,小团边缘整齐,周围无凝集颗粒。
若各对照组成立,试验结果可信,被检血清稀释终点以“+ +”应判为阳性。
反向间接血凝试验的操作和判断与间接血凝试验一样,反向间接血凝试验仅仅是用抗体,致敏红细胞来检测组织悬液或细胞培养液中的抗原。
4.间接血凝和反向间接血凝的应用 间接血凝和反向间接血凝试验是以红细胞为载体,根据抗原抗体的特异性结合的原理 ,用已经抗原或抗体来检测未知的抗体或抗原的一种微量、快速、敏感的血清学方法。其用途很广。
(1) 测定非传染性疾病的抗体,如类风温性关节炎的类风温性RF因子及自身抗体、激素抗体等。
(2) 测定传染性疾病的抗体,用于流行病学的调查,如布氏杆菌病、螺旋体病。猪的霉形体肺炎等。
(3) 用间接血凝试验所作某些病毒、细菌的鉴定和分型。
(4) 间接血凝试验可用于血浆中IgG和其他蛋白组分的测定及对免疫球蛋白的基因分析
(5) 间接血凝试验用于进出口动物及其产品的检疫,如用间接血凝试验检疫进口猪的霉形体肺炎。用反向间接血凝试验检查进口肉品中口蹄疫病原体等。
5.影响间接血凝试验结果的因素
(1) 试验者在各个步骤中操作要精确 ,加量要准确 ,所用器材必须洁净,液体试剂要无菌,这是保证实验结果正确的前提。
(2) 作为致敏红细胞的抗原或抗体一定要经过纯化 ,否则会出现非特异性反应,同时要求抗原和抗体 有一定的浓度和效价。
(3) 致敏红细胞对温度、时间和pH值都有一定要求。温度一般在37℃ ,时间为30min, pH值为6.4。
(4) 不同动物种类和不同个体的动物的红细胞致敏的敏感性亦有差异 ,因此同一批试验一定要用同一批的红细胞。
(5) 健康兔血清稀释液一定要现用现配 ,鞣化的红细胞也应立即致敏。

参考文献
[1] 黄祯祥主编,医学病毒学基础及实验技术,1990
[2] 郑武飞主编,医学免疫学,人民卫生出版社,1989
[3] 韩澄源主编,间接血凝技术,科学出版社
[4] 杜平主编,医用实验病毒学,人民军医出版社1985
[5] Lennett EH,Halonen P,Murphy FA,Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases Principles and Pracice,1989(2)
[6] Calne R. Transplantation Immunology, Clinical & Experimental. Oxford
Unixersity, 1984
biogoogle 生物秀探花 发表于 2008-9-16 21:01:52 | 显示全部楼层
琼脂凝胶免疫扩散试验

凝胶中抗原-抗体沉淀反应最早于1905年为研究利泽甘氏现象而首先应用。1932年将本方法应用于鉴定细菌菌株,但当时在凝胶中出现的沉淀带仍被认为是利泽甘氏现象。1946年Oudin在试管中进行了免疫扩散试验,对抗原混合物进行分析。1948年Elek和 Ouchterlony分别建立了琼脂双向双扩散法,可以同时鉴定、比较两种以上抗原或抗体,并相继研究了免疫扩散的理论依据,使免疫化学分析技术向前迈进了一大步。
随着科学技术的进步,免疫扩散法与其他技术结合产生了许多新的技术,如免疫电泳、免疫液流电泳、酶免疫扩散等,使之在生物学和医学等领域得到更广泛的应用。
在凝胶扩散法之前的许多免疫化学技术,不能提供抗原混合物标准分析方法。最初设计出凝胶扩散试验的目的是为了对单一抗原或抗体进行定量分析,在凝胶中的任何免疫化学研究都必须从定性分析开始。应该注意的是:无论是在定量或定性试验中,只有在抗血清中存在足够浓度的抗体情况下才能检出抗原,反之亦然。
(一) 原理 琼脂或琼脂糖是一种含有硫酸基的多糖体,高温时能溶于水,冷后凝成凝胶,内部形成一种多孔的网状结构,而且孔径很大,可允许大分子物质(分子量可达百万以上)自由通过。孔径的大小还决定于琼脂浓度,琼脂浓度大,孔径相对较小,琼脂浓度小,孔径相对较大。1%琼脂凝胶的孔径约为85nm,由于琼脂或琼脂糖具有很好的化学稳定性,凝胶后含水量大,透明度好,来源方便,易处理,因此是一种很好的扩散介质。
抗原和抗体的分子量一般都在20万以下,在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时所受的阻力很小,基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同,因此其扩散系数不同,在凝胶中扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇,形成抗原抗体复合物,若两者在相遇处比例适当,则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大,颗粒增大,因而不再继续扩散而产生沉淀,呈现出线状或带状,这种的沉淀就形成了一个“特异性屏障”,凡在免疫学上与其相同的抗原或抗体分子不能通过,而性质不同的那些分子可以通过这个屏障而继续扩散,直到形成它们自己的复合物为止。这样,不同抗原所形成的沉淀各有各的位置,从而有可能将混合物分离开来,进行比较研究。此种反应称为琼脂凝胶扩散,或琼脂扩散,或免疫扩散,其形成的线状或带状的“特异性屏障”称为免疫沉淀线或免疫沉淀带,简称沉淀线或沉淀带。
(二) 特异性和交叉性 抗原是指能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞,并能与之结合引起特异性免疫反应的物质。抗原分子表面具有特殊构型的、有免疫活性的化学基团,称为抗原决定簇。抗体是在抗原刺激下产生,并能与抗原特异性结合的免疫球蛋白,一个抗体分子上有两个可变区,可变区决定了每种抗原决定簇均有其对应的一种抗体。抗血清是针对某种抗原不同抗原决定簇的抗体混合物,一般从经免疫动物的血清中获得,因此称抗血清。
抗原决定簇与其对应的抗体结合,形成抗原抗体复合物,这是一个对一的反应过程,具有高度的物异性。所有血清学反应都是以此为基础的,因此具有高度的特异性,琼脂凝胶免疫扩散试验也不例外,同样具有高度特异性。
一种抗原往往具有多种抗原决定簇。不同抗原可能存在相同的抗原决定簇。同一种抗体分子与不同抗原中存在的与该体抗体相对应的相同抗原抗原决定簇之间的反应就是血清学反应中的交叉反应。应当注意,这种交叉反就也是特异性的,而且是血清学反应所固有的。琼脂扩散试验同样也存在一定的交叉反应。因此,琼脂扩散试验的特异性还依赖于抗原或抗体的纯度。提供具有高纯度和高特异性的抗原或抗血清,对琼脂扩散试验的特异性是至关重要的。可使用单克隆抗体以提高反应特异性。
有时抗体分子与抗原决定簇的结合反应并不总是一对一的,抗体分子有时会与不对应的、但在化学结构上极其相似的抗原决定簇结合,这就是非特异性反应。
非特异性反应的产生并不总是由于抗体对抗原决定簇的识别错误所引起,与反应有关的其他因素,如离子强度、pH值等也会造成非特异性反应的产生。
(三) 敏感性 琼脂扩散试验的敏感性依赖于琼脂的浓度、凝胶的厚度、粘性抗原、抗体的浓度。比较而言,单扩散试验的敏感性要高于双扩散试验。
在单扩散试验中,加入到凝胶中的抗体的浓度对敏感起决定作用。若浓度较小,则敏感性就高;反之,敏感性就低。
就双扩散试验而言,试验的敏感性还依赖于抗原孔和抗体孔之间的距离,以及抗原、抗体的相对深度。孔间距减小,敏感性提高;孔间距增大,敏感性降低。抗原抗体的相对浓度对试验的敏感性也是很重要的。例如,当孔间距为5mm,抗原孔中加入0.01μg抗原(卵清蛋白),则可检出其相应的抗体(兔抗卵清蛋白抗体)量为抗体孔中至少含有0.1μg抗体。而当将抗原量提高到0.1μg时,则不能检出0.1抗体,而需要每孔中含1.0μg抗体时才可检出。表2-10比较了各种血清学反应的敏感性。
表2-10 各种血清学反应敏感性比较表

反 应 各 称

敏感性(抗体,μg氮/ml)

免疫电泳
3-20

双向双扩散
0.2-1.0

双向单扩散
0.008-0.025

间接血凝反应
0.005 
.

补体结合反应
0.01-0.1

中和试验
0.004-0.01

(四) 各试验因素对琼脂扩散试验结果的影响
1.电介质 抗原抗体反应有二个阶段,反应的第二段通常需要有电介质存在。电介质能降低抗原体复合物表面的阴电荷,可促使沉淀。但电介质浓度太高或太低都会影响试验结果。最常用的电介质是NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥缓冲液、PBS等。
2.pH值 大多数抗原抗体反应的最适pH值为6-8。当反应的pH值接近蛋白质(抗原或抗体)的等电点时,会造成抗原或抗体的自凝或非特异性凝集或沉淀,从而影响其正常扩散。
3.温度 反应时的温度直接关系到反应速度。适当提高反应温度可使分子运动加快,从而加速反应进程。过高的温度会造成抗体复合物的重新解离,甚至因蛋白质变性而造成凝集或沉淀,从而影响了结果。
4.温度 适当的温度在琼脂扩散试验中也是很重要的。温度过小造成琼脂凝胶中的水分蒸发,使凝胶干枯甚至干裂,造成凝胶体积缩小,密度加入,影响扩散。如果湿度过大,使水蒸汽在盒盖上凝成水滴,掉在琼脂板上或抗原、抗体孔内,同样会影响试验结果,但究竟大多温度为宜,由于没有这方面的数据,因此需要在实践中摸索掌握。
(五) 琼脂扩散试验的分类 琼脂扩散试验根据扩散方向可分为单向扩散(one - dimensional diffusion)和双向扩散(two-dimensional diffusion)两类。扩散物质向一个方向直线扩散者称为单向扩散;扩散物质同时向两个互相垂直的方向扩散,或向四周辐射扩散者称为双向扩散。
根据扩散物质的种类又可分为单扩散(simple diffusion)和双扩散(double diffusion)。单扩散是指在一对抗原抗体中仅有一种成分扩散,而另一种成分扩散,而另一种成分不扩散所进行的试验;双扩散是指在一对抗原抗体中两者均彼此扩散所进行的试验。
据此,琼脂扩散试验可分为以下四种类型:即单向单扩散试验,单向双扩散试验,双向单扩散试验,双向双扩散试验。在检疫实践中最为常用的是双向双扩散试验,一般所称的琼脂扩散试验多指双向双扩散试验。
1.单向单扩散试验(simple diffusion in one-dimension) Oudin于1946年首次记述了本方法,因此也称为Oudin法。本法主要用于对抗原成分的分析研究和抗原鉴定等。目前已少用。但由于本法是一种经典试验,具有一定的代表性,故在此作一叙述。
(1) 方法
① 试管准备 单向单扩散试验常在细的小试管,毛细管或特制的玻璃小管内进行。这种管的常用规格为:内径1.5-2.0mm ,管壁厚0.2-0.5mm, 长100mm。由于琼脂凝胶一般不易着于玻璃表面,为防止试验样品从凝胶和管壁间的小缝渗漏,因此最好事先用琼脂凝胶包被小管内壁。包被的方法是将小管在60-70℃水谷中预热(勿让水进入小管内),用加样器加入0.2%60-70℃的琼脂,然后用加样器吸弃琼脂,将小管置4℃使附于壁上的琼脂冷凝。最后将附于管壁的琼脂凝胶中的水分用真空泵抽干或阴干。用于包被的琼脂凝胶中不能加入任何盐分,否则干后会有盐晶析出,影响试验结果。
② 琼脂凝胶制备 琼脂凝胶常用缓冲液配制。琼脂(agar)或琼脂糖(agarose)的最终浓度为0.2%-0.5% ,同时可加入最终浓度为0.01的硫柳汞或叠氮钠作为防腐剂。将琼脂溶解后冷至45℃时加入最终浓度为1:4-1:20的对应抗血清,并混合均匀。趁热将含有抗血清的琼脂细心地加入到已准备好的小管内。加入的高度为35-40mm,待冷凝后于4℃湿盒内保存备用。
③ 加样与扩散 在含有抗血清的琼脂上层滴加高度约为3mm待测抗原,然后置湿盒内于恒温下扩散。扩散时常用温度为37℃。
(2) 结果判定与分析
① 反应特点
a. 抗原在含有抗血清的琼脂凝胶中扩散形成浓度梯度,在比例适当处形成沉淀带。此沉淀带随着抗原向前扩散而向前移动,至达到平衡状态。最初形成的沉淀带( precipitationzone)由于抗原浓度随着抗原扩散而逐渐增大,造成抗原过生剩而重新溶解,故沉淀带的后缘模糊,而前缘(leading edge)则是齐平的。
b. 当反应物中仅存在一对抗原抗体时,则只出现一条沉淀带;当存在两对或两对以上抗原抗体时,则理论上每对抗原抗体可形成各自的沉淀带。
② 各试验因素对结果的影响 抗原抗体界面至沉淀带前缘的距离称为沉淀带的穿透力(penetration)。
a. 穿透力与扩散时间的平方根成线性正比关系;
b. 穿透力与抗原的初始浓度成正比;
c. 穿透力与凝胶中的抗体浓度成反比;
2.双向单扩散试验(simple diffusion in two-dimension) 双向单扩散也称辐射扩散(radial diffusion)。其特点与单向单扩散试验基本相同,但操作更为简便易行,也可用于抗原的定量分析。因此应用更为广泛。
试验在平皿或玻璃板上进行。琼脂的最终浓度为0.8%-1.0% 。琼脂凝胶中抗血清的浓度根据抗体效价和试验需要而定。琼脂凝胶厚度为2-3mm。在凝胶中打直径为2-5mm的小孔,孔内滴加抗原液。抗原从小孔向四周扩散,在比例适当处与凝胶中的抗体结合,形成肉眼可见的白色沉淀环, 进行定量试验时,通常是固定抗血清浓度,稀释抗原。先测定已知浓度的抗原形成的沉淀环的大小,并画出标准曲线,再测定待测抗原形成的沉淀环大小,与标准曲线比较,即可计算出待测抗原的浓度含量。沉淀环的直径或面积与抗原初始浓度的关系可用下式表示:
S=So+KCAg
式中S为沉淀环的直径或面种;So与抗原孔的面积或直径有关,当抗原孔的面积或直径一定时,则So为一常数;K为一常数,与凝胶中抗血清的浓度成反比,当抗血清浓度保持不变时,K为常数;CAg为抗原的初始浓度。
3.单向双扩散试验(double diffusion in one-dimension) 单向双扩散试验是1953年由 oakley在单向单扩散试验中的基础上发展起来的。试验原理和反应特点与双向双扩散试验基本相同(详见双向双扩散试验)。与单向单扩散试验相比,本法的扩散距离小,敏感性和精度较差;与双向双扩散试验相比,本法的操作复杂,所以目前很少应用。在此仅做一简单介绍。
首先准备直径2-5mm,长40mm的试验小管,一端封口以后,在底部加入约5mm高的血清,然后小心加入45℃左右的琼脂凝胶,凝胶柱的高度为5mm(注意:凝胶与血清的界面必须清晰无混合现象,也无气泡),置室温或4℃使琼脂冷凝,最后加入5mm高的抗原液后封口。再置37℃扩散,并判定结果。
4.双向双扩散试验(double iffusion in two-dimension) 双向双扩散试验是由Elek和 Ouchterlony于1948年在同一时期分别建立的,习惯上也称为Ouchterlony法。这是一种目前在诊断实验室中最为常用的血清学试验。一般所称的琼脂扩散试验即指本方法。
(1) 琼脂凝胶板的制备
① 试验用板或平皿的准备 试验用板或平皿可以是玻璃制品,也可以是塑料制品。无论用何种制品,均应无色透明,表面平整光滑,厚度均一。玻璃制品经久耐用,表面不易有划痕等损伤,但不易附着琼脂凝胶;塑料制品与琼脂凝胶的粘附性好,但不耐用。实验室可根据自己的情况选用。
试验用板或平皿在制备琼脂凝胶板之前应充分洗净。
② 琼脂凝胶制备 试验中常用优质琼脂糖制备琼脂凝胶。用pH7.0-7.2、1/15mol/L PBS加入最终浓度为0.8%-1.0%的琼脂或琼脂糖。为防腐需要,可加入最终浓度为0 .01%的叠氮钠或硫柳汞,于0.105-0.112MPa高压5min使琼脂溶化,然后置2-5℃保存备用。蜊用前在水浴中溶化。
③ 制板 琼脂凝胶板的制备目前主要有两种方法,即单层法和双层法。由于玻璃制品不易附着琼脂凝胶,因此用双层法较为满意;而塑料制品易附着琼脂凝胶,用单层法即可取得满意效果。
单层法:在板上浇一层2-3mm厚的试验用琼脂凝胶即可。
双层法方法一:首先在玻璃板上制一层厚度为1mm的2%的琼脂凝胶,待冷凝后再在其上铺一层厚度为2-3mm的试验用琼脂凝胶。打孔仅在上层。
双层汉方法二:先在板上铺一层不含任何盐分的0.5%琼脂凝胶,厚度以0.5-1mm为宜。待冷凝后阴干或于80-90℃烘干,然后再在其上浇一层厚度为2-3mm的试验用琼脂凝胶。
(2) 打孔、加样与扩散
琼扩试验的打孔模型有许多种。在检疫中常用的是以正六边形状为基本模型 。

试验中,各孔的孔径一般为3-5mm,中央孔和周边孔边缘之间的距离为2-5mm,加样时以所加样的液面与凝胶平面齐平为准。
加样完毕后,将板置一密闭湿盒内于37℃扩散 24-72h,然后判定结果。
(3) 结果判定和分析
① 在单一反应体系中(即仅有一个抗原孔和一个抗体孔,抗原和抗体可以是混合物)。
a. 从理论而言,不同抗原与其相应的抗体反应形成各自的沉淀线,沉淀线的位置在两个反应物孔之间。
b. 就一对抗原抗体而言,若两者浓度相当,则沉淀线位于两反应物孔的中间;若两者浓度相关较大,则沉淀线将移向低浓度一方。
c. 若某一对抗原抗体的扩散系数相同,则沉淀线呈直线状;否则沉淀线呈弧形,并弯向扩散系数小的一方 。


② 在多反应体系中(即有多个抗原孔和抗体孔),沉淀线除具有单一反应体系的特点外,相邻孔形成的沉淀线之间可出现干扰、抑制、偏离和融合等连接情况,以此可判断出两个相邻孔中的反应物的关系。多反应体系中沉淀线的连接情况与相邻孔中反应物的相关关系可见表2-11。
表2-11 多反应体系中沉淀线的基本类型与反应物的相关关系表

沉淀线类型

干 扰

抑 制

偏 离

融 合

相关关系





完全

完全相同






不  同





部分

部分相同






部分相同
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补体结合试验

补体是一组正常血清蛋白成分,可被免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或(抗原),称作补体结合试验(Complement Fixation Test,CFT)。CFT准确性高,容易判定,对抗原纯化要求不严格,因而普遍用于传染病的诊断。该试验的不足之处是操作繁锁,尤其是对所用试剂的准备和量化要求较严。
(一) 原理 CFT包括两个系统,第一为反应系统,又称溶菌系统,即已知抗原(或抗体),被检血清 (或抗原)和补体。第二系统为指示系统(亦称溶血系统),即溶血素+绵羊红细胞,溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清,它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原-抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此,如果试验系中的抗原和抗体是对应的,形成了免疫复合物,定量的补体就被结合,这时加入指示系统,由于缺乏游离补体,就不产生溶血,即为阳性反应。反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体,不能形成免疫复合物,补体就游离于反应液中,被指示系统,即溶血素+绵羊红细胞免疫复合物激活,而发生溶血,即阴性反应。为了测定阳性血清中抗体的效价,可将血清作系列稀释,其结果是由完全不溶血逐步达到完全溶血,发生50%溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
在进行CFT主试验之前,抗原、补体、绵羊红细胞和溶血素必须经仔细测定。所加补体的量必须准确,补体少导致不完全溶血,出现假阳性结果;反之,超量的补体不能被反应系统的免疫复合物完全结合从而出现假阴性结果。超量的抗原影响补体的结合,抗原不足不能完全结合补体。
在CFT操作中,经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”。即被检血清在无抗原存在的情况下结合补体。这有多种可能的原因,主要原因是血清取自感染动物,在血清中存在免疫复合物;或者血清被细菌污染,通过其它途径激活了补体。
(二) 分类 补体结合试验分直接法、间接法和固相法。
1.直接法 如图2-9所示,该法为最常用的操作方法,在试管中加抗原、被检血清和补体,在一定温度下感作一定时间后,加溶血素和红细胞,再感作一定时间后判定结果。直接法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。常量法试剂总量一般为0.5ml。微量法一般为0.125ml。前者在试管内进行,后者在U形底的96孔微量反应板内进行。
2.间接法 如图2-10所示,该法用于禽类血清抗体的测定(如鸭、火鸡、鸡等)。因其血清抗体与相应的抗原形成复合物后不能结合豚鼠补体,需再加一种抗该抗原的兔抗体,后者形成复合物后可结合豚鼠补体,然后再加补体和溶血系统成分。与直接法相比间接法多加一种特异性免疫抗体,多进行一次感作。其结果判定正好与直接法相反。发生溶血时表示抗原已和血清中的抗体结合,阻止了兔抗体与抗原的结合, 补体仍然游离存在, 然后与溶血系结合,发生溶血,即为间接CFT阳性;反之,若血清中无相应的抗体存在,抗原则与兔抗体结合形成免疫复合物结合补体,不发生溶血,即为间接CFT阴性。
3.固相法 固相法的原理与直接法相同,其不同点是所有的反应是在琼脂糖凝胶反应皿中进行。其操作程序为先将溶血素致敏的红细胞液加入融化后冷至55℃的1%琼脂糖凝胶中,混匀,倾注入特制的塑料反应皿内。(反应皿规格为90(25mm,凝胶量为25ml)。待其凝固后打孔,孔径为6mm,孔距不得小于8mm。然后将在37℃温箱中感作一定时间的抗原+被检血清+补体混合物取25ul加入孔中,37℃感作一定时间,观察溶血环的直径以确定结果的阴阳性。
(三) 操作方法 以牛边虫病直接CFT的常量法加以详细介绍。对补体效价的测定,以前国内均采用100%溶血测定法,而目前国际流行50%溶血测定法。当溶血现象近于零或趋近完全时补体量的明显变化只能引起轻度的溶血现象,而在趋近50%溶血时极小量的补体变化可引起程度显著不同的溶血现象。因此50%溶血测定法显然要比100%测定法敏感度高,对补体的测定更精确。本节只介绍50%补体溶血测定法。
1.制备绵羊红细胞悬浮液
(1) 采血 绵羊(最好母绵羊)颈静脉无菌采血。将40ml的血与60ml阿氏液混匀,冷藏备用。供血羊一次采血量最多不要超过200ml,采血间隔不少于6周。
(2) 洗红细胞 将10ml阿氏液保存的绵羊血通过纱布过滤倒入40ml刻度离心管内,另加30ml巴比妥缓冲液(VBS),混匀。在水平转子离心机上离心10分钟(500×g)。吸弃上清液,加VBS至原来的量,再次离心,如此离心洗涤三次。吸弃上清液。 每管约加10ml VBS,混匀。将悬液倒入15ml容量的刻度离心管中,离心 10分钟(500×g)。储存于4-8℃冰箱备用。红细胞可保存5-6天。
(3) 制备5%绵羊红细胞悬浮液
① 选择一管洗过的红细胞。如果红细胞与液面间出现溶血应再离心洗涤,直至清亮。若多次洗涤仍有溶血,则表示红细胞太脆或缓冲液有问题,应弃去不用。
② 记录红细胞的毫升数,吸弃上清液,用VBS稀释红细胞,使成为5%的红细胞悬液(1ml红细胞+19ml VBS)。
③ 为了精确配制悬液可用分光光度计检测红细胞的浓度(波长550nm)
取1ml约5%的细胞悬液,加19ml的蒸馏水混匀。用分光光度计检测其透光度,在表上查出红细胞的浓度(见附录3)。
如果红细胞的浓度不等于5%,可加VBS或离心去除VBS校正浓度。计算如下:
需加(或去除)VBS的量=实测红细胞浓度(细胞悬液总量/5-细胞悬液总量。
注意:一般在最初配制悬液时稍浓于所需浓度,校正时只加一定量的VBS即可。
(4) 致敏红细胞 将5%的红细胞悬液与等量适当稀释的溶血素混和,置室温15分钟.混和时总是将溶血素加到细胞液中。
2.配制标准比色管
(1) 准备血红素液 取10ml 5%的红细胞悬液,加到15ml的刻度离心管中,离心5分钟(500×g)。吸弃上清液,加蒸馏水至9.5ml,混匀,这时红细胞完全溶解,液体应是清亮的。加进0.5ml 17%的氯化钠液,混匀,使其保持等渗。
(2) 配制比色管 按表2-12配制标准比色管,试管规格为12x75mm.因所用抗原、血清、补体和溶血素均为无色液体,所以用VBS代替。血红素为5%红细胞溶血液。
表2-12 标准比色管的配制

溶血度(%)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

血红素(ml)
0.0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
.0.8
0.09
0.1
5%红细胞(ml)
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.0
VBS(ml)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4

离 心

混 均

3.补体效价的测定
(1) 试验当天打开一瓶补体,解冻。若是冻干的补体需加定量蒸馏水复原。
(2) 取0.2ml补体加9.8mlVBS(低温)作1/50稀释。按表2测定补体效价。补体原液置3-4℃保存。
表2-13 补体效价的测定举例

试管号

1

2

3

4

5

6

1/50补体(ml)
0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

VBS(ml)
0.29

0.28

0.27

0.26

0.25

0.24

致敏红细胞(ml)
0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

将试管置37℃水浴锅内,感作30分钟,每5分振钟荡一次。与标准管比较,记录血度此量。
(3) 以溶血度为横坐标,补体的用量为纵作标绘制曲线。找出50%溶血的补体所用量,为一个单位补体。
(4) 补体效价计算
基础计算:用于CFT的补体用量为3个单位补体。
X=滴定前补体稀释倍数/(30(1个单位补体量)
X:配制3个单位补体所需补体原液的稀释倍数。
校正计算:在试验中发现补体在感作中损失一部分活性,根据经验需使用基础计算补体用量的1.5倍,即直接配4.5个单位的补体。但习惯上仍称为3个单位。其计算公式为:
X=滴定前补体稀释倍数/(45(1个单位补体量)
4.溶血素的效价测定
(1) 稀释溶血素按表3稀释溶血素。
表2-14 溶血素的稀释

稀释度

溶血素量(ml)

生理盐水量(ml)

  1:100
   溶血素原液*
0.2
19.8

  1:500
   1/100溶血素
1.0
4.0

  1:700
   1/100溶血素
1.0
6.0

  1:800
   1/100溶血素
1.0
7.0

  1:900
   1/100溶血素
1.0
8.0

  1:1 000
   溶血素原液*
2.0
18.0

  1:1 200
   1/100溶血素
0.5
5.5

  1:1 400
   1/100溶血素
0.5
6.5

  1:1 600
   1/100溶血素
0.5
7.5

  1:1 800
   1/100溶血素
0.5
8.5

  1:2 000
   1/100溶血素
0.5
9.5

  1:2 200
   1/1 000溶血素
2.0
2.4

  1:2 500
   1/1 000溶血素
2.0
3.0

  1:2 800
   1/1 000溶血素
2.0
3.6

  1:3 000
   1/1 000溶血素
1.0
2.0

  1:4 000
   1/1 000溶血素
1.0
3.0

  1:5 000
   1/1 000溶血素
1.0
4.0

   * 如果溶血素用等量甘油保存,所需量加倍。
(2) 配制100ml 5%的绵羊红细胞悬液并致敏。取17个试管,每管加1.5ml 5%的红细胞悬液,然后分别加不同稀释倍数的溶血素1.5ml,混匀。室温静置15分钟。
(3) 配制1/50稀释的补体。
(4) 用不同稀释倍数的溶血素致敏的红细胞分别做补体效价测定。结果参考表2-15。
表2-15 溶血素测定结果举例

溶血素稀释度

补体用量(1/50稀释)

0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
 1:100





95

80

60

20

0

 1:500





98

85

70

25

0

 1:700





98

95

70

20

0

 1:800





9

90

70

20

0

 1:900





98

90

70

30

0

 1:1 000





98

80

70

30

0

 1:1 200





95

90

70

25

0

 1:1 400





95

90

70

25

0

 1:1 600





98

80

70

25

0

 1:1 800





98

90

70

20

0

 1:2 000





95

75

70

10

0

 1:2 200





98

80

45

20

0

 1:2 500




98

98

80

45

15

0

 1:2 800



98

98

90

70

50

0

0

 1:3 000


98

98

85

85

65

50

0

0

 1:4 000
98

98

95

95

90

90

60

50

0

0

 1:5 000
98

98

98

95

90

90

50

45

0

0

   表内“-”表示100%溶血;“0”表示不溶血
(5) 查出50%溶血时1/50稀释的补体用量,并换算为未经稀释的补体用量(方法:50%溶血时1/50稀释的补体用量除以50)。
(6) 一个单位的未经稀释的补体用量作为纵坐标,溶血素的稀释倍数作为横坐标,绘制 50%溶血曲线。取保持50%溶血时补体用量最低而溶血素稀释倍数最高的溶血素的稀释度做为溶血素试验用效价。本例所测溶血素的效价为1:2 000,试验用稀释度为1:1 800。
5.抗原效价的测定
(1) 将抗原和阳性血清分别做两倍系列稀释。
(2) 方阵试验 补体、溶血素按前试验的结果稀释。试管排列参考表2-16。
试验程序:0.1ml抗原+0.1ml血清+0.1ml补体→4-9℃18小时→+0.2ml致敏红细胞→37℃水浴30分钟→判定结果。
同时建立下列对照管:
一个单位补体对照:0.1ml一单位补体+0.2ml VBS+0.2ml致敏红细胞。
二和三单位补体对照:同上。只是分别采用二和三个单位补体(一个单位补体=2份VBS+1份三单位补体;二个单位补体=1份VBS+2份三单位补体)。
(3) 测定结果,见表2-16。
表2-16 抗原效价测定举例

抗原

稀释度

阳性血清稀释度

阴性血清

1/5

抗原

对照

1/5
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
 1/5
0

0

0

0

0

0

0

0

0

10

10

 1/10
0

0

0

0

0

0

0

25

25

20


1/20
0

0

0

0

0

0

25





1/40
0

0

0

0

0

0

75





1/80
0

0

0

0

0

25






1/160
0

0

25

25

75







1/320
50

75










1/640











血清对照












一个单位补体对照:50%溶血;二个单位补体对照和三个单位补体对照:100%血;红细胞对照:不溶血。
已知阳性血清效价为1/80-1/160。试验结果表明:1/5和1/10稀释的抗原有抗体补体作用;1/80或1/40稀释的抗原所测阳性血清的效价为满意。所以选择1/40稀释的抗原做为边虫补体结合反应的工作单位。
6.正式试验
溶血素:1:1 800稀释
抗原:1:40稀释
补体:3个工作单位
首先,对被检血清和阴、阳性对照血清做1/5稀释,60℃水浴灭活30分钟,然后做进一步稀释。试验方法见表2-17。一般阳性血清应多做几个稀释度。
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表2-17 血清效价测定



血清试验管

血清对照表

C1

对照

C1

对照

C1

对照

抗原

对照

红细胞

对照

1/5

1/10

1/20

1/5

1/10

1/20

血清(ml)
0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1






抗原(ml)
0.1

0.1

0.1







0.1


VBS(ml)



0.1

0.1

0.1

0.2

0.2

0.2

0.1

0.3

补体(ml)
0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1


第一次感作
4-8℃18h

致敏红细胞
0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

第二次感作
37℃水浴30min

   表2-17内C1、C2和C3代表一、二和三单位补体。阳、阴性血清对照和被检血清同时做。检验结果举例见表2-18。
表2-18 边虫病补结试验结果举例


试验管

抗补体对照管

结果判定

1/5

1/10

1/20

1/40

1/80

1/160

1/5

1/10

1/20

样品:1
0

0

0

50






1/40

   2









阴性

   3
0

5

50

75






1/20

   4
50









1/5

   5




25

40




>,=1/160

   6
25

90





40



抗补体

阳性血清




50

90




1/80

阴性血清









阴性

一个单位补体对照:50%溶血。
二和三个单位补体对照:100%溶血。
抗原对照:100%溶血。
红细胞对照:不溶血。

附1 阿氏液(Alsever’s)的制备
成分:A.氯化钠         4.18g
无水柠檬酸钠      8.0g
加水到900ml
B.右旋葡萄糖      18.66g
加水到100ml
方法:1.溶解盐到蒸馏水中。
2.溶解葡萄糖到蒸馏水中。
将A和B液分装。120℃(15磅)灭菌15分钟。将A和B液混合无菌分装到三角瓶中,密封。一般按每瓶60ml分装,以备采血。
用法:采血时,1.2份阿氏液加1份血,即:60ml阿氏液加50ml血。
附2 巴比妥钠缓冲液(VBS)的制备
成份:3-5二乙基巴比妥酸    5.75g
5-5二乙基巴比妥钠    3.75g
氯化钠          85.0g
6水氯化镁         1.68g
氯化钙          0.28g
蒸馏水          2000ml
方法:首先将巴比妥酸溶解到500ml热的蒸馏水中,加入巴比妥钠和氯化钠,然后加水至2 000ml,混匀。加氯化镁和氯化钙,15磅灭菌20分钟。pH值应为7.2。将其按每瓶100ml分装储存于4-9℃。
用法: 用前将所配液体用蒸馏水作1:5稀释。
附3 不同浓度的红细胞光密度表制备方法
每毫升5%的绵羊红细胞悬液中约含有109个红细胞。可用细胞泥的体积测其浓度。将阿氏液保存的绵羊血用VBS洗涤三次,最后一次离心后记录离心管中红细胞的体积(毫升数)。然后加VBS制备约5%的绵羊红细胞悬液(1ml细胞泥加19ml VBS)。取1ml的红细胞悬液加 19ml的蒸馏水混匀。用分光光度计以550nm波长测其光密度。重复配制五次红细胞悬液,测量五次,最后取其光密度平均值。 从5%绵羊红细胞悬液中通过去掉或加入VBS配制1-9%浓度的绵羊红细胞悬液,分别测定其光密度值,即可制备浓度与光密度表。
程序:
1.
打开分光光度计,预热20分钟。
2.
调整波长为550nm。
3.
配制血红素液:1ml 5%的红细胞悬液加19ml蒸馏水,混匀。
4.
封闭光源,调整零点。
5.
用蒸馏水调光密度到100。
6.
测光密度。

表2-19 70型分光光度计绵羊红细胞标准浓度与光密度表

光密度

红细胞浓度(%)

光密度

红细胞浓度(%)

20

8.65

38

5.3

21

8.4

39

5.1

22

8.15

40

5.0

23

8.0

41

4.85

24

7.7

42

4.7

25

7.5

43

4.6

26

7.25

44

4.4

27

7.05

45

4.3

28

6.9

46

4.2

29

6.7

47

4.05

30

6.5

48

3.9

31

6.35

49

3.8

32

6.15

50

3.7

33

6.0

51

3.6

34

5.85

52

3.5

35

5.65

53

3.4

36

5.55

54

3.3

37

5.4

55

3.2
chenjunwei 生物秀才 发表于 2009-2-9 09:15:25 | 显示全部楼层
实用材料,感谢您的奉献!
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