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小弟我刚进实验室4个月,老板交给我一实验,限我3个月内完成,实验目的是ELISA法血清学验证新的结核蛋白对肺结核的诊断价值。现在没有师兄师姐带,实验室老师也是用的试剂盒法。我花了一周看了一些相关的中英文文献,都做摸索了好多次,结果都是阳性血清OD值与 正常血清OD值 接近(1.1-1.3左右),阴性对照、空白对照都很正常(OD值 <0.1)
实验方法如下
1 抗原包被:抗原,用包被缓冲液稀释为1ug/ml,取100μl/孔加到酶标板中,4℃包被过夜。洗涤:用洗涤液(PBST)洗涤3次,3min/次。
2 封闭:加5%小牛血清封闭液100μl每孔,37℃湿盒封闭2小时以上,洗涤4次。
3 加待测血清(一抗):待测血清用PBST梯度稀释成1:400(阳性一组 阴性一组),加PBST做阴性对照一组,每孔加100μl,37℃湿盒1小时,同上洗涤4次。
4 加酶标二抗:二抗(羊抗人IgG)用PBST稀释成1:2000,37℃湿盒60min,同上洗涤5次。
5 加底物显色:每孔加100μl底物TMB溶液,37℃湿盒15min。
6 终止反应:各孔加入终止液50μl,终止后20分钟内读OD值。
7 测值:用ELISA阅读仪在450nm波长下读取吸光度(OD)值
PS:1.抗原为生物技术的重组抗原。
     2.不加抗原,只加封闭液和血清、二抗,OD值明显降低为0.113-0.142。
    3.正常血清是症状、胸部CT、gene检测、TS-POT、涂片等排除肺结核患者的血清。
目前个人认为不会是封闭液问题,并且排除血清污染问题。可能原因:抗原不纯?抗原非特异性?
急需各位前辈指点,不胜感激~~~~    (距离老板的最后期限不多了,呜呜呜.......)

共 14 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-8-8 13:15

yxshengwu 生物秀才 发表于 2017-8-7 12:41:53 | 显示全部楼层

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本帖最后由 yxshengwu 于 2017-8-7 12:44 编辑

1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

2.在稀释度的基础上,缩短酶标二抗浓度及反应时间。

程序建议:
1 抗原包被:抗原,用包被缓冲液(PB)稀释为 1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml ,分别取100μl/孔加到酶标板中,4℃包被过夜。
2 封闭:弃去孔内液体,加5%小牛血清(PBS稀释)封闭液100μl每孔,37℃湿盒封闭2小时,洗涤1次。
3 每组包板条件,加待测血清(一抗):待测血清用PBST梯度稀释成1:400(阳性一组 阴性一组) 1:800,1:1200,加PBST做阴性对照一组,每孔加100μl,37℃湿盒1小时,同上洗涤3次。
4 加酶标二抗:二抗(羊抗人IgG)用PBST稀释成1:2000,37℃湿盒30min,同上洗涤5次。
5 加底物显色:每孔加100μl底物TMB溶液,37℃湿盒15min。
6 终止反应:各孔加入终止液50μl,终止后20分钟内读OD值。
7 测值:用ELISA阅读仪在450nm波长下读取吸光度(OD)值

通过上述程序,如果运气不错,可以选择到合适的程序。如果没有得到合适的程序,可以进行分析得到后续的事宜操作。如果需要,可加我QQ:2914421090沟通。
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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:28 来自手机 | 显示全部楼层

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yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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之前已经对抗原和血清进行棋盘滴定,效果不好,增加血清及二抗稀释浓度均是阳性的OD值低于1
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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:33 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:37 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:40 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:44 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:53 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:38:59 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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袁阳 生物秀才 发表于 2017-8-7 18:39:02 来自手机 | 显示全部楼层
yxshengwu 发表于 2017-8-7 12:41
1.可能原因:待测血清稀释度不够。建议:用稀释液对血清样本进行梯度稀释,如:1:400,1:1:800,1:1200等

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