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TA克隆

骑驴上月球 于 2017-7-20 20:41 发表 [复制链接]

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本人是刚进实验室的菜鸟,最近再做TA克隆遇到问题了,想请各位大神指点一下。问题是做蓝白斑筛选时感受态长不出来,试剂为新配的,载体使用的是PMD18-T,感受态DH5a,都为新买的,培养基也没问题,但就是不长菌,在做的过程中有2次长出了菌,第一次做了菌液pcr,所有的都为一条带,一次为了验证后再做菌液pcr,先做了菌落pcr,出现的全是涂抹带,请问这是什么情况,有没有知道的?谢谢。

共 3 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-8-14 17:41

abigen 生物秀才 发表于 2017-7-24 15:11:35 | 显示全部楼层

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链接多长的片段,TA克隆要用Taq酶扩增,带A,不能用高保真的酶,转化不长,说明你没有链接上,检查T4链接酶和回收的片段长度还有纯度
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骑驴上月球 生物秀才 发表于 2017-8-14 17:41:42 | 显示全部楼层

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abigen 发表于 2017-7-24 15:11
链接多长的片段,TA克隆要用Taq酶扩增,带A,不能用高保真的酶,转化不长,说明你没有链接上,检查T4链接酶 ...

连接酶在做这个实验的时候使用过没问题,回收的片段在600`1000左右,经过DNA纯化,经OD值检测了,不低。
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骑驴上月球 生物秀才 发表于 2017-8-14 17:41:42 | 显示全部楼层
本帖最后由 骑驴上月球 于 2017-8-14 17:51 编辑
abigen 发表于 2017-7-24 15:11
链接多长的片段,TA克隆要用Taq酶扩增,带A,不能用高保真的酶,转化不长,说明你没有链接上,检查T4链接酶 ...
求解答,哭泣哭泣
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