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电转染过程中的影响因素

dealer 于 2017-6-21 16:18 发表 [复制链接]

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一 电转的简介
电穿孔转染,作为物理方法的一种,不仅能将DNA、RNA,还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效。简便的基因转移系统,具有其他转移方法无法比拟的优越性,如操作简便、快捷,可重复性强,转染率高,适用广谱等,尤其对目前一般认为难转的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。
二 电转原理
电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后,在细胞膜上暂时形成小孔或开口,把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核的技术。其过程简述如下:首先在电击过程中,细胞膜上出现穿孔,质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触,并在细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后,质粒脱离复合物并扩散至细胞质内,开始瞬转;同时小部分质粒进入核内与染色体整合,开始稳转。一旦DNA扩散至细胞,膜上小孔会关闭。
三 电穿孔转染条件的选择
1 电场参数
电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。
不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数,故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
2脉冲过程
1)脉冲波形
脉冲波形主要分为两种:1、方波脉冲;2、指数递减波脉冲。
方波脉冲是指:电压瞬间升至预设电压,保持电压放电,然后瞬间终止放电。
一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲,有较高的转染效率和细胞存活率。
指数递减波脉冲是指:先对电容充电,然后让电容完全放电,其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。
2)脉冲时间
脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中,脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中,脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间,等于电容(C)与电阻(R)的乘积,单位是ms。在参数优化中,增加电压应当降低脉冲时间,而减小电压则应当增大脉冲时间。
3)脉冲次数
一般而言,对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲,因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。
3细胞因素
用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定期的细胞差,电转后,细胞膜的恢复能力强,而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml,当细胞生长密度大于3*106/ml,转染效率会下降。原因除了细胞老化外,细胞过密会使相邻细胞相互作用增大,甚至使细胞相互融合,从而导致电场的局部微扰,使电场环境无法均一化,细胞体积越大对电击越敏感,所需电场强度也越小。
4 质粒因素
从质粒浓度看,细胞密度为1*106/ml,DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高,但是到达一个峰值后,随DNA用量增加而转染率逐渐下降,其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度,过量便会产生毒性,使存活率降低,不利于转染率提高。
进行小分子量的分子转染时(siRNA/miRNA),应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时(DNA),应使用低电压,长脉冲时间。
从质粒的纯度看,用高纯度的DNA才 能提高电转的效率,且应注意以下几点:首先DNA/RNA应该超纯(A260/A280>1.8),其次应不含内毒 素,同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。
5 温度  
一般情况下,电转的过程是在室温下进行,但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大,但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解,并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应,因此,实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴,会影响DNA摄入,因为电击后冰浴可增强细胞收缩,细胞膜上的 电穿孔封闭较慢,延长外源性DNA摄入时间,从而提高其摄入量。在室温环境下,虽然细胞膜上的孔 封闭速度快,但在随后2h,质粒还可通过电内化进入细胞,因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且,室温下细胞在5 min内即闭孔,在4℃的环境下穿孔状态可保持4h,穿孔封闭缓慢降低了存活率,同时细胞在低温下更容易受到损伤。
因此,综合考虑摄人量和存活率,大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。
6电转染试剂的选择
电击会对细胞造成一定程度的伤害,在转染试剂的选择上要注意,应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂,如engreen的Entranster-E,将电击对细胞的损伤降到最低。
7电转后培养液的选择
细胞在电击后十分脆弱,其 培养液的选择应注重提高细胞的存活率,一般选择 低渗的RPMI 1640+10%FCS。除此之外,可参考 加入50 mmol/L海藻糖+1.25%DMSO,因为海藻 糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用,并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。此外, 有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因,电 击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子。

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