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细胞培养的冷冻保存原理

江南的韵味 于 2017-6-12 09:02 发表在 [分享] [复制链接]

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在低于-700C的超低温条件下,有机体细胞内部的生化反应极点缓慢,乃至间断。因此,采用恰当的方法将生物材料降至超低温,即可使生命活动固定在某一期间而不变老去世。当以恰当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时,其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻留,便是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中,以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-700C的低温条件),并在此温度下对其长期保存的进程。而复苏便是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的进程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞仍是体外培养的器官都能够进行冻存,并在恰当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。假设将细胞悬浮在纯水中,跟着温度的降低,细胞表里的水分都会结冰,所构成的冰晶会构成细胞膜和细胞器的损坏而致使细胞去世。这种因细胞内部结冰而致使的细胞危害称为细胞内冰晶的危害。假设将细胞悬浮在溶液中,跟着温度的降低,细胞外部的水分会首要结冰,然后使得未结冰的溶液中电解质浓度添加。假设将细胞露出在这么高溶质的溶液中且时间过长,细胞膜上脂质分子会遭到损坏,细胞便发生渗漏,在复温时,大量水分会因此进入细胞内,构成细胞去世。这种因保存溶液中溶质浓度添加而致使的细胞危害称为溶质危害或称溶液危害。当温度进一步降低,细胞表里都结冰,发生冰晶危害。可是假设在溶液中参与冷冻保护剂,则可保护细胞免受溶质危害和冰晶危害。因为冷冻保护剂简略同溶液中的水分子联系,然后降低冰点,减少冰晶的构成,而且经过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度,使细胞免受溶质危害,细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时,一般以很快的速度升温,1-2分钟内即恢复到常温,细胞表里不会从头构成较大的冰晶,也不会露出在高浓度的电解质溶液中过长的时间,然后无冰晶危害和溶质危害发生,冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的构造和功用。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不一样的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度,直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻进程中会发生如下改动:当细胞被冷至-50C时,因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点,细胞表里溶液仍未结冰;当被冷至-5~-150C之间时,细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍坚持未结冰情况。细胞内未结冰的水分子会比细胞外有些结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其效果是,细胞内水分子为了和细胞外水分子坚持化学能的平衡,会向细胞外活动。冷冻速度不一样,细胞内水分向外活动的情况也不一样:假设冷冻速度慢,细胞内水分外渗多,细胞脱水,体积减小,细胞内溶质浓度增高,细胞内不会发生结冰;假设冷冻速度快,细胞内水分没有满意的时间外渗,效果跟着温度的降低而发生细胞内结冰;假设冷冻速度非常快(即超敏捷冷冻),则细胞内构成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃情况(玻璃化冷冻)。Luyet(1973)证实液体的凝聚可分为两种方式:一种是晶体化,溶液中的分子呈有序摆放;另一种情况对错晶体即玻璃化,液体中的分子呈无序情况,坚持未凝聚前的情况。


不一样的冷冻速度已然能使细胞内发生不一样的生理改动,也能够对细胞发生不一样的危害。当冷冻速度过慢时,细胞脱水严重,细胞体积严重缩短,超越一定程度时即失掉活性。一同冷冻速度过慢,还会致使细胞外溶液有些结冰,然后使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高,发生溶质危害。当冷冻速度过快时,细胞内水分来不及外渗,会构成较到冰晶,构成细胞膜及细胞器的损坏,发生细胞内冰晶危害。超敏捷玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为抱负的冷冻方法。细胞表里呈玻璃化凝聚,无冰晶构成或构成很小的冰晶,对细胞膜和细胞器不致构成危害,细胞也不会在高浓度的溶质中长时间露出而受损。

不一样细胞的最适冷冻速率不一样。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C/min、70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C~3000C/min,故对一种细胞进行冷冻保存之前,首要需求测定其最适冷冻速率,以保证取得最高的冷冻存活率。

冷冻保存温度
冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度,在此温度下,细胞生化反应极点缓慢乃至停止,但经过长期保存,在复苏后仍能坚持正常的构造和功用。

不一样的细胞和生物体以及运用不一样的冷冻保存方法要取得一样的冷冻保存效果,冷冻保存温度能够不一样。但从实习和效益的观念启航,液氮温度(-1960C)是 如今最佳的冷冻保存温度。在-1960C时,细胞的生命活动几乎彻底间断,但复苏后细胞的构造和功用无缺。假设冷冻过程稳当,一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。使用-700C~-800C保存细胞,短期内对细胞的活性无明显影响,但跟着冻存时间延伸,细胞存活率明显降低。在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。



点评

小琳小 海!外直播 t.cn/RxBC0cw 禁闻视频 t.cn/Rxl1r5o 某省长说:“请全省人民对我严格监督。” 网友评论:人民拿什么监督你?报纸归你管,电视归你管,网络归你管,我这条信息都归你们管,说删就删,从来也没跟我商量过.   发表于 2017-6-14 17:46

共 0 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-6-12 09:02

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