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【OneShine】PCR程序设置及体系配置

ONESHINE 于 2017-6-2 17:50 发表在 [分享] [复制链接]

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1、DNA一般为双链,首先,我们需要把它进行解链,从而产生两条单链,让引物结合上去,达到复制的目的。一开始我们设置的高温,刚好能够使得DNA双链解体。约94~98℃,用3到5min即可。此反应中我们用的TAQ酶(嗜热杆菌中提取的DNA聚合酶)也是高温启动的,初始的高温适合其开始在体系中的活性,但是约15分钟的高温会导致其半衰期,从而失去活性,使得反应效率降低,所以高温的时间不宜过长。
2、在2~4步骤中,我们进行循环,以达到指数扩增的作用,大量得到所需DNA产物。
3、在2步循环中,第一次的高温是进行预变性,在每一次的开链中都需要在进行一次变性,从而达到开链的目的。预变性同样是94~98℃,时间控制在30S到2min之间,根据片段不同长度而不同。
4、在第三步循环中,我们进行退火,使得温度控制在引物和模板链刚好能够结合的温度使得引物和模板链进行结合。温度约为37~70℃,引物是个人根据基因片段不同而自行设置的,具体设置方法参见引物设计的内容。
设计引物的时候会给出相应的参考TM值,一般小于TM值5℃算作本次pcr的退火温度。如果不行,则根据具体情况调整,梯度PCR,tallPCR反应都是可以尝试的。
5、第四步延伸,在引物结合在模板上进行合成,复制得到引物起始和模板链尾部的新片段。
温度约为72℃,时间:taq酶的活力是1000bp/min,根据所需片段,自行计算延伸时间。Pfu酶延伸速率为500BP/min
在多次循环以后,得到的片段大多是两个引物控制的部分。即目的片段。在第二步到第四步的过程中每次经过解链,引物结合目的片段,延伸,这三个过程,就新生成一次的目的片段,所以按照推测,PCR产物应该是成对数增长的。即一变二二变四的反应过程。但是酶的活力和反应体系等的影响,并不能保证每一次都能够完全反应,所以PCR产物的增长曲线,实际上更接近于细菌的生长期,对数期成熟期和消亡期的增长曲线。
6、第五步进行补齐延伸,因为酶的活力并不是稳定的,我们的条件也不一定能够达到标准反应条件,所以酶的效果并不一定能够达到最好的情况,最后设置7到10分钟的补齐延伸,能够让得到产物完整性更加好。
程序的编写很大程度上取决于酶的使用说明书,参照说明书来写。
最后需要设置4℃恒久保存,        在来不及收样的时候能够保持其片段不变性。
PCR体系设计:
一般PCR采用50微升体系,加入以下试剂
PS Buffer(5X)                   5μL
dNTP                             4μL
模板                            1μg(cDNA200ng足够,基因组400ng一般可以)
正向引物                           10μM的加入1μL
反向引物                                同上
                              活力达到5U即可,一般0.5μL足够
水(ddH2O)                     补齐50μL体系
PCR体系根据酶的不同而不同,每一种酶的说明书上都有标明体系和所需程序。
在以上设计中,可以先混合MIX在进行分装,混合内容为模板,dNTP,PS Buffer ,引物各自不同,酶需要最后加入,其活性很容易丧失,要避免此类可能。酶也可以混入mix。

注:OneShine PCR试剂盒,点击即可查看!

共 0 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-6-2 17:50

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