| 第三章 实验动物的微生物学、寄生虫学质量控制
第一节微生物控制的意义和标准 在通常条件下饲养的实验动物，生活在微生物的环境中，当动物从母体无菌的子宫产出之后，就立即被周围的微生物所污染。其中有的微生物可能被动物体重新排除( 过路的)，有的则栖居在体内，并对宿主的生理代谢、组织形态、 药物的效应以及致癌物的作用等产生较大的影响，从而干扰动物实验的结果。因此, 微生物的存在对实验动物质量产生极大的影响。 一、不同微生物、寄生虫对实验动物的影响 １．人畜共患病微生物：既可危害动物自身，还会传染给饲养人员( 如流行性出血热、狂犬病、布氏杆菌病、沙门氏菌等)。
２．影响动物健康的动物传染性疾病微生物：虽然不引起人员发病，但可严重影响动物群体健康。如小鼠的脱脚病(ectromelia,又称鼠痘 mouse pox) 是由鼠痘病毒感染引起的烈性传染病，虽不是人畜共患病，但其传播快，使大批动物死亡或被迫全部淘汰,重新引种建群,给科研和生产带来很大的损失。
有些动物貌似健康，实际上隐性感染某些微生物，如仙台病毒(sendai virus)感染的孕鼠，可使小鼠繁殖力降低，新生仔死亡率增加。潜在感染可使动物机体发生各种(包括反应性、体内代谢、功能等)变化,或导致体内微生物丛失衡。 进而引发显性疾病使实验动物机体发生病变或导致死亡。
３．影响和干扰实验： （１）仙台病毒和绿脓杆菌存在时，如把动物用于放射或使用免疫抑制剂实验可引起发病死亡。（２）７８年国内某单位声称在实验中分离到２８珠乙脑病毒，但经鉴定其中２１珠为鼠痘病毒，占７５％。
４．多数细菌对动物无致病作用，并且有益无害。如普通大肠杆菌，乳酸杆菌和多种厌氧菌。而近年来微生态学研究表明，许多正常菌群当遇到内外环境的变化或在实验条件下可发生菌群失调，引发动物疾病。三株口服液（双歧杆菌、乳酸杆菌、粪链球菌），微生态调节剂。
综上所述，实验动物微生物控制无疑是保证实验动物质量和动物实验顺利进行的关键。 二、实验动物微生物学和寄生虫学等级分类和控制标准 (一)参照国际实验动物微生物质量控制和我国的实际情况，根据中华人民共和国技术监督局GB14922-94《实验动物微生物学和寄生虫学监测等级》规定，将实验动物按微生物控制程度，划分为四个等级。
一级 普通动物(conventional animal，CV) 不携带主要人兽共患病原和动物烈性传染病的病原。
二级 清洁动物(clean animal，CL)除一级动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。
三级 无特殊病原体动物(specific pathogen free animal，SPF)除一、二级动物应排除的病原外,不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。
四级 无菌动物(germ free animal，GF)无可检出的一切生命体。
(二) 细菌、真菌、病毒和寄生虫控制指标
1. 细菌、真菌指标应符合表3.1规定。2. 病毒指标应符合表3.2规定。
3. 寄生虫指标应符合表3.3规定。 <原网页图表比较混乱，暂时省略。————longer>
第二节 实验动物的培育 一、无菌动物的人工培育 （一）无菌动物的饲育环境 无菌动物一般饲养在隔离器(Isolator)内,隔离器是一种对微生物绝对密闭的装置，其内部空间物体能承受高压蒸气或化学物灭菌，目前世界应用最广泛的是聚氯乙烯透明薄膜隔离器。隔器离内的用品、饲料、人工乳、手术器械等，都必须经过灭菌处理。 1. 灭菌措施 常用的灭菌方法是高压蒸气灭菌,过氧乙酸灭菌和放射线（γ-射线)灭菌方法。 2. 无菌实验 在饲养无菌动物过程中,必须对隔离器中的动物及排泄物、饲料、饮水等物品进行定期检测，确保无菌状态。 （二）无菌动物种群的建立 方法一：无菌剖腹产(子宫摘除术)：是建立无菌动物种群最常用而可靠的方法。 1.主要装置：
手术隔离器（Operation Isolator) 2.手术隔离器用新配制的2%的过氧乙酸充分喷雾灭菌,保持24小时之后通气吹干。经微生物检测合格后使用。 3.选择待剖腹产的动物: 选择活泼、健康、发育良好、个体大的雌鼠。经微生物检测无垂直感染性疾病。雌鼠的品系、来源、繁殖方式和胎次，均应有准确的记录。通常选用第二、三胎孕鼠，其仔鼠发育较好，个体大，容易人工哺乳。 4.剖腹产术: 将雌鼠麻醉或脱颈椎处死后，立即置入2%过氧乙酸的烧杯中，浸泡10秒钟，取出后使其仰卧，用碘酒棉球擦拭腹部,从腹中线处切开，暴露子宫,将子宫连同胎儿一同摘出，随即放入2%的过氧乙酸烧杯中,用无菌纱布将子宫包好， 移入隔离器内，先用2%NaHCO3溶液中和子宫表面残留的过氧乙酸，然后切开子宫取出胎仔，用纱布擦去胎仔鼻和口部羊水，刺激胸部,促进呼吸。此操作应在30-35℃下进行，当胎仔变成鲜红色时即可去掉胎盘。此时可将胎仔移入另一隔离器喂养。 从处死雌鼠到胎仔的取出，动作要快，通常要求在5～6分钟内完成，否则，胎儿容易窒息死亡。 5. 哺乳 饲养在隔离器中的哺乳方法有两种 一是乳母代乳(Foster suckling)，二是人工哺乳(Hand Rearing)。 ①乳母代乳哺育法 将一个雌性动物的幼仔转给另一个雌性动物哺育称为代乳。当前已有不少单位饲养无菌大鼠和无菌小鼠等，引用已经培育的无菌动物,作为代乳母鼠,将代乳母鼠所生仔鼠留下2-3只，其他淘汰。以代乳母鼠的垫料撒在剖腹仔鼠的身上，将其放在代乳母鼠旁边，确定剖腹仔鼠已吃了代乳母鼠的奶以后，即可将该母鼠所生仔鼠全部淘汰。哺育3周后，剖腹仔鼠即可断乳。 代乳的母鼠应选择10-12周龄的雌鼠，与雄鼠交配时间应比剖腹雌鼠提前2～3 天。该代乳雌鼠在产前2-3天更换垫料。为防止污染,每个饲养隔离器最好只放一只代乳雌鼠和一窝同胎剖腹的仔鼠。 ②人工哺乳 如果没有无菌动物作代乳母，人工哺乳是唯一的方法。由于新生仔鼠太小，人工哺乳较困难,最初七天每隔四小时哺乳一次，每日六次,八日龄后每日五次。小鼠每日授乳量因小鼠的品系、发育状况或饲喂次数,人工乳的组成成份等而稍有变化。一般日授乳量为体重的20％左右。体重为 2g的小鼠每日的总授乳量大约为0.54 ml，每次(一日六次)为0.09ml。 下面是两种人工乳汁的配方。 ①家兔乳作大、小鼠人工乳（法国），人工或机械挤出家兔乳，经冷冻干燥，装入塑料袋中，用60Ｃo照射灭菌，饲喂前用无菌水稀释到原浓度。 ②山羊乳作小鼠人工乳（日本）,山羊乳经低温灭菌,即60℃30分钟后，直接饲喂。 6.预产期的判断 哺乳动物的预产期，往往和临产期不一致，手术过早， 仔畜太小，不易成活，手术过晚,子宫颈口开放，胎膜破裂，产道病菌污染胎仔,最适时间应掌握在自然分娩前2～6小时。所以临产期的正确判断至关重要。概括起来有以下几点： ①触诊法 选择腹部膨满，外阴口潮红的孕畜，从后腹侧用拇指和食指触摸胎仔，当胎仔的头部和躯干大小一致，为临产期。此法适用于大、小鼠、豚鼠等。豚鼠常用耻骨联合检查法。当耻骨联合开启至能容纳拇指时(20～24mm)为临产期。 ②推算法 以交配日期推算临产期的方法比较常用。此法适合于有明显交配标记和交配行为的动物。常见实验动物的妊娠期和哺乳期见表3.4 。 表3.4 常见实验动物的妊娠期和哺乳期 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 动物名称 妊娠期（天） 哺乳期（天） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 小 鼠 19(18-21) 20(18-25) 大 鼠 20(19-22) 21(18-25) 豚 鼠 68(62-72) 20(18-25) 家 兔 30(29-35) 30(28-35) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ③观察法 动物临产前会出现很多生理现象和行为,如食欲下降、运动减少或不安、外阴部潮红肿大可见分泌物。 ④人工延长产期 对于临产期的正确判断，即使经验丰富的人也难免有误。补救的办法是在上述临产期判断的基础上，给孕畜肌注黄体酮(人用量的5倍) 可延长产期一日左右。 剖腹产手术道理很简单,但做起来并不容易,经常有两个困难,其一是人工乳的配置, 其二是人工哺育方法,对于小鼠来讲,最大的困难是后者, 剖腹仔鼠不会从人工乳头吸引乳汁,所以经常要隔着隔离器的手套,用胃管给那么小的动物每隔3~4小时哺乳一次,1955年Plesants就开始培育无菌小鼠,到1958年终于培育出了无菌Swiss小鼠。因此， 目前世界上几乎所有的无菌小鼠Plesants建立的无菌小鼠的子孙。 方法二 实验动物的药物净化: 首先对用于净化的动物群进行全面的微生物学监测。一般选取健康的和携带寄生物（包括细菌、病毒和寄生虫）相对较少的动物作为种鼠，置于清洁环境中饲养，作为药物净化的对象。 清除体外寄生虫可用适当浓度的杀虫剂溶液(0.5～1%的敌百虫溶液)进行体表除虫,水温37℃，然后用0.1%的新洁而灭药浴，对动物进行体表消毒，把动物移入隔离器中。清除体内寄生虫、细菌可用几种驱虫药物和广谱抗菌素交替使用，如青霉素、链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等。动物经药物净化处理后，进行各项监测，以确定净化的效果。从中选取净化较好的动物作为种鼠繁殖。 二、悉生动物的培育及饲养 （一）基本概念 悉生动物(gnotobiotic animal)即己知菌动物或已知菌丛动物。是无菌动物培育成功之后相继出现的,悉生动物是指动物体内外所携带的其他生物(如病毒、细菌、寄生虫等)是已知的。从广义讲无菌动物也属于悉生动物。 （二）悉生动物的培育 悉生动物的饲养和管理与无菌动物相同，将动物饲养在隔离器内。不同的是悉生动物的隔离器内带有一定的已知菌。 已知菌动物，通常是在无菌动物的基础上经人工植入已知菌的动物。根据研究需要常给无菌动物植入单菌或多种菌。 当向无菌动物植入一种细菌时叫单菌动物(monogotoxenic)， 二种细菌叫双菌动物(dignotoxenic)，三种以上细菌叫多菌动物(polygnotoxenic)。不同国家对不同动物人工植入的细菌种类不同，如表3.5为不同国家或单位对豚鼠植入的细菌。 表3.5 不同国家悉生豚鼠植入的细菌 ────────────────────────── 菌 种 日本 法国 美国 中国医科院 ────────────────────────── 大肠埃希氏杆菌 √√ 表皮葡萄球菌 √ 白色葡萄球菌 √ 粪链球菌 √ √ √ √ 乳酸杆菌 √ √√ 脆弱拟杆菌 √ √ √√ 双歧杆菌 √ 费新尼亚梭菌 √ ────────────────────────── 注：√√表示此菌植入了两个不同的株。 （三）无菌动物和悉生动物的生物学特征 1. 无菌动物 ①生长发育体形较小 无菌大、小鼠一般生长发育比普通大、小鼠体形较小，而无菌动物寿命要比普通动物的寿命长。 有资料认为,不同种属无菌动物体重影响不易样,无菌鸟类比普通鸟体重大, 大小鼠基本相同,而无菌豚鼠、家兔比普通动物要小（由于缺乏肠道细菌， 不能分解利用纤维素）。 ②盲肠肥大 无菌动物的盲肠比普通动物要大5～6倍，无菌豚鼠和家兔的盲肠可达体重的1/3。关于这一现象有两种解释，一是因微生物缺乏导致大分子酸性粘蛋白在盲肠内大量积聚，胶体渗透压增高，水分在盲肠内潴留；二是无菌动物体内水分潴积，大量进入盲肠的水分超出了大肠的回收能力，有较大量的水分经粪便排出，所以无菌动物通常排稀便，排尿量少。认为是主要是由于没有细菌，不能分解肠内有毒的物质。 ③肠壁变薄、肝脏重量下降、心脏变小。肠道胆汁循环、白血球均有变化。 ④免疫系统的改变 在缺乏微生物作用下细胞免疫和体液免疫器官发育迟缓，网状内皮系统、淋巴组织发育不良，脾脏小、无二级滤泡，淋巴小结内缺乏生发中心，故产生丙种球蛋白的能力很弱，血清中lgM、lgG水平低。 免疫功能处于原始状态，应答速度慢。过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。用低分子无抗原性饲料喂饲无菌动物时，血清中几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体。 ⑤抗辐射能力强 普通动物受辐射后，往往是由于细菌感染引起并发症而造成动物死亡。无菌动物不存在这种情况，因而提高了抗辐射能力。 2. 悉生动物 悉生动物 可以弥补无菌动物的某些缺点，无菌动物抵抗力较弱，饲养管理困难，而悉生动物抵抗力明显增强，易饲养管理。在免疫学实验中，无菌动物不发生迟发性过敏反应，而感染一种大肠杆菌的悉生动物就可以发生迟发性过敏反应。
三、SPF动物的培育及饲养 （一）SPF动物的培育 建立SPF动物群,必须严格地选择原种。 1.其原种可来源于无菌动物或悉生动物，将其饲养于SPF屏障系统中，使之自然感染特定病原体以外的一般微生物； 2.亦可剖腹取胎后,在屏障设施中由SPF亲代动物抚育。 （二）SPF动物的饲养设施 SPF动物必须饲养在屏障系统内,并经严格的微生物控制,方可保证其质量标准。除全屏障系统隔离器外,SPF动物饲养于相对屏障系统中，常有以下 三种方式： 1. 净化空气层流架， 是一种较简便的气流屏障系统，适宜做动物实验。 它的作用是通过空气净化和连续层流两方面的作用而实现的。空气经过初、中、高三级过滤，洁净度达到万级。 层流架比隔离器容量要大，可在架子内进行肿瘤接种，注射、手术等多项实验工作。 层流架一般作为清洁系统的补充设施。 2. SPF动物房,是饲养和生产SPF动物的大型设施。 动物房内部的空气全部经过过滤除菌。 利用空气的压力梯度来防止外界未经过滤除菌的空气进入。 饲料、饮水、垫料、笼具均灭菌后方可进入。 工作人员进入SPF动物房时，需经过充分的淋浴，然后穿上灭菌工作服、鞋、帽、戴上口罩和手套。 （三）SPF动物的饲养管理 饲养在屏障系统中的SPF动物生产繁殖性能好,不易为外界有害微生物所污染。 可得到较高的生产效益。 一般每周只需更换一次垫料。 及时添加饲料、饮水，保证食盒中不缺食，饮水瓶不断水。 饲料现已作为商品供应的SPF动物灭菌料，也可自己配制,但应注意营养的全面，高压灭菌过程中易受破坏的维生素等成分的添加量要有保险系数，以保证动物生长获得较充足全面的营养。 SPF动物饲养的关键在于要有严格的管理制度和操作规程，饲养人员和动物实验人员一定要熟练地掌握饲养设施的具体操作方法和技术，以保证生产和动物实验中SPF 动物不被污染。 屏障系统的动物一但感染了病原微生物，它的传播往往比开放系统更加强烈，动物的损失将更大。 四、清洁动物和普通动物的饲养 （一）清洁动物也称最低限度疾病动物(Minimal disease animals)。 原种群为屏障系统中的SPF动物或剖腹产动物，饲养在亚屏障系统，它比SPF动物要求排除的微生物和寄生虫少，并且在进行血清病毒抗体检查时，经常可检出一定滴度的抗体,但是在任何时候都不应具有明显可见的疾病症状、脏器的病理变化和异常的死亡。 清洁动物所使用的饲料(要满足全价营养的需要)、垫料、用具等都要经过消毒灭菌处理，饮用水除高压灭菌外，也可采用PH2.0-2.5的酸化水，水质标准不能低于城市生活饮水标准，工作人员进入动物室需换无菌的工作服、鞋、帽、戴口罩进行操作。 （二）普通动物的饲养 饲养在开放的环境中，未经积极的微生物控制的实验动物叫普通动物。 它要求不带有能够感染人的微生物和寄生虫,并排除动物群中可能发生的烈性传染病病原体,如动物的体外寄生虫、沙门氏菌、流行性出血热病毒、小鼠的鼠痘病毒等。 为了预防人和动物共患病及动物群中烈性传染病的发生，普通动物在饲养管理中也必须采取一定的防护措施，如： 饲料、垫料要消毒并防止野生啮齿动物的污染，饮水要符合城市卫生标准。 不喂青饲料。 外来动物必须严格隔离检疫。 房屋要有防野生动物及防昆虫的设备。 要坚持经常性的环境卫生及笼具的清洗消毒。 严格处理并及时淘汰死亡及患病动物。 普通动物仅供教学实验和一般性实验用，不适合用于研究性实验。 第三节 实验动物微生物和寄生虫监测 一、实验动物细菌学监测 （一）监测的意义和目的 定期对各级实验动物群进行微生物学、寄生虫学监测, 以确定其是否符合原定级别,是保证实验动物质量的手段之一。通过监测可掌握动物群中传染性疾病的流行情况，及时诊断、发现并控制疾病的传播，保证动物健康。根据动物群中致病菌和条件致病菌的带菌状况，可将动物分成不同的级别。另外研究者可根据不同的实验目的选择不同级别的实验动物、确保实验结果的可靠性。 （二）监测方法 细菌监测是对实验动物致病菌携带状况的动态观察。其方法多采用病原学方法，即从动物体内分离培养病原菌。如鼠棒状杆菌的检验,在无菌条件下，取动物气管分泌物,回盲部内容物及病灶组织。将标本直接接种于血琼脂平皿，37℃培养48小时，鼠棒状杆菌在血琼脂平皿上呈白色，不透明、不溶血、触之较硬、不易乳化的菌落，48小时后菌落周围呈锯齿状。挑取可疑菌落纯培养进行革兰氏染色及生化鉴定。根据不同致病菌的特性，取样、培养及鉴定方法不尽相同。由于泰泽氏病原体由于不能在人工培养基上生长，通常采用醋酸可的松激发方法。当小鼠体内感染了泰泽氏病原体后，可出现松毛、弓背及内脏病变等，将动物处死、剖检。取病变组织直接压片、镜检并结合病理检查结果做出判断。 目前国内、外亦有对实验动物部分致病菌检验采用了血清学方法，如使用凝集试验方法检查鼠伤寒沙门氏菌、鼠棒状杆菌及支气管败血性波氏杆菌等，但由于其特异性不如分离培养法，当抗体效价较低时仍以分离培养法的结果为准。
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发表于 2004-11-20 21:06
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