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siRNA细胞转染常见问题及解答

dealer 于 2017-9-26 11:13 发表在 [分享] [复制链接]

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问:siRNA导入细胞有哪些方法,哪种最好?
答:siRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法,而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。
问:哪种转染试剂效果好?
答:在选择转染试剂时,一般要考虑的是特定的细胞株,而不是被导入细胞中的物质。脂质体试剂的毒性较大,建议选择非脂质体的转染试剂,如Entranster系列试剂。
问:如何筛选转染试剂?
答:好的转染试剂有以下特点:1、对siRNA有较高的转染率;2、对细胞的毒性小。在mRNA水平检测siRNA导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。
问:在转染时我发现有不少细胞死亡,应该如何处理?
答:转染后大多数细胞死亡表明:转染条件需要进一步地优化。在优化转染条件时需要考虑以下因素:转染试剂和细胞特有的自身条件。例如:siRNA与脂质体试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
问:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?
答:对于难转染的细胞的转染,如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪检测的方法。
问:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?
答:转染后细胞死亡,原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂,如engreen的Entranster试剂,另外,如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的,出现细胞死亡的现象可能正是由于基因干扰引起的,如果由于细胞死亡而影响检测的话,可以适当调整检测时间。实验条件的优化,包括转染前细胞密度调整,转染浓度,检测时间等。

共 0 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-9-26 11:13

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