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新鲜实体组织样本的制备
(一)酶处理法  此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用,所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外,乙二胺四乙酸(EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子,而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用,因此,几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织,提高细胞产出效率。下面仅介绍组织消化的一般过程,对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。
1.将组织剪成l~2mm3左右的小块。
2.用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块,胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1%~0.5%。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25%胶原酶,胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强,它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1~0.3ug/ml。用大于组织量30~50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织,需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定,一般来说,胰蛋白酶需作用20~60分钟,胶原酶需4~48小时。在消化过程中,如发现组织块已分散而失去块的形状,经摇动即可成为絮状悬液,则可取出少量液体在显微镜下观察,可见分散的单个细胞和少量的细胞团,可认为组织已消化充分。
3.消化完毕后,将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过,以除掉未充分消化的组织。
4.已过滤的细胞悬液经800~1000rpm低速离心5~10分钟后,弃上清液,加PBS液,轻轻吹打形成细胞悬液,细胞计数后即可使用。
(二)机械法  机械法分散实体组织,用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆,再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤除单细胞悬液;采用网搓法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块,所以常与其他方法配合使用。
1.剪碎法
(1)将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水;
(2)用剪刀将组织剪至匀浆状;
(3)加入10ml生理盐水;
(4)用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管中;
(5)离心沉淀1000r/min,4~5min,再用生理盐水洗3遍,每次以低速(500~800r/min)短时离心沉淀去除细胞碎片。
(6)以300目尼龙网滤去细胞团块;
(7)细胞用固定液固定或低温保存备用。
2.网搓法
(1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上;
(2)把剪碎的组织放在网上,以眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边加生理盐水冲洗,直到将组织搓完;
(3)收集细胞悬液,500~800r/min离心沉淀2min;
(4)固定细胞或低温保存备用。
3.研磨法
(1)先将组织剪成1~2mm2 大小组织块;
(2)放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水;
(3)转动研棒,研至匀浆。
(4)加入10ml生理盐水,冲洗研磨器;
(5)收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀500~800r/min,1~2min,再以生理盐水水洗3遍,离心沉淀;
(6)固定或低温保存细胞悬液,备用。

共 7 个关于本帖的回复 最后回复于 2017-9-25 15:58

wx_杨敏_SUWSv 生物秀才 发表于 2017-9-22 21:02:04 | 显示全部楼层

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你好!我是研二的一名学生,最近在做流式细胞仪检测植物DNA倍性的问题,但是结果差强人意,和预期结果不太一致,不知道是制备样品的问题还是仪器参数设置的问题,能否帮忙看一下?谢谢!
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wx_杨敏_SUWSv 生物秀才 发表于 2017-9-22 21:04:45 | 显示全部楼层

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附件中是我做的实验结果图,请帮忙看一下!谢谢!

17-9-20_Tube_001_20092017163939.pdf

17.03 KB, 下载次数: 6, 下载积分: 秀基因 -1 个

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钰森生物 生物秀才 发表于 2017-9-25 10:18:54 | 显示全部楼层
wx_杨敏_SUWSv 发表于 2017-9-22 21:04
附件中是我做的实验结果图,请帮忙看一下!谢谢!

你好,实验影响因素很多,不知道您的样本是什么植物?植物样本处理起来容易产生细胞碎片,解离液的选择很重要,另外样本一定要够新鲜。
光看结果图很难看出问题,具体您是怎么制备样品设置仪器参数不得而知。请提供更详细的说明,看看这边经验是否能帮您解决,只能说尽力。建议是在怀疑的点上做排除法多摸索几次。
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钰森生物 生物秀才 发表于 2017-9-25 10:21:30 | 显示全部楼层
wx_杨敏_SUWSv 发表于 2017-9-22 21:04
附件中是我做的实验结果图,请帮忙看一下!谢谢!

我这边做植物的相对是较少一些~
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wx_杨敏_SUWSv 生物秀才 发表于 2017-9-25 10:48:37 来自手机 | 显示全部楼层
钰森生物 发表于 2017-9-25 10:18
你好,实验影响因素很多,不知道您的样本是什么植物?植物样本处理起来容易产生细胞碎片,解离液的选择很 ...

非常感谢您能回复,我做的植物材料是普通烟草,标准品用的是普通马铃薯,制备样品使用的方法是一步法,没有离心的步骤,使用的解离液是mGB和WPB,荧光强度在65左右的是马铃薯的,烟草和马铃薯都是四倍体,我想了解转基因烟草中是否存在八倍体,但是实验结果显示不出来。我想除了实验操作的问题,在仪器的使用上是否也有问题
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钰森生物 生物秀才 发表于 2017-9-25 14:55:28 | 显示全部楼层
wx_杨敏_SUWSv 发表于 2017-9-25 10:48
非常感谢您能回复,我做的植物材料是普通烟草,标准品用的是普通马铃薯,制备样品使用的方法是一步法,没 ...

首先不好意思的是这边做植物的经验确实少。您可以换一种样本制备方法试试,据了解流式应该是要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应在20%以下,碎片等过多是导致实验失败的原因之一。另外,有一种植物样本做流式专用的滤网,具体什么牌子记不清了,您需要的话可以搜索看看。(回复了一条有截图,需要审核。只好另外回复一条纯文字。文献截图在同板块另外一条帖子“文献截图”)
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wx_杨敏_SUWSv 生物秀才 发表于 2017-9-25 15:58:38 来自手机 | 显示全部楼层
好的,非常感谢!
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