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现在在做SDS-PAGE实验,想问一下蛋白样品在什么情况下需要稀释,具体又该如何稀释呢,还有2x,5x,6x的loading buffer又有什么区别,该怎么用??如果能举例说明就更好了,比如说当样品蛋白浓度为1.5mg/ml,现在上样时每孔加10ug,用的是5x的loading buffer,具体该怎么加?麻烦各位大神详细帮我解答下好吗,拜托了!

共 10 个关于本帖的回复 最后回复于 2015-10-26 17:12

MrSMALL 生物秀才 发表于 2015-10-14 16:11:35 | 显示全部楼层

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Teddydai 生物秀才 发表于 2015-10-14 19:20:10 | 显示全部楼层

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首先蛋白浓度为1.5mg/ml,也就是说等于1.5ug/ul。每个孔为10ug的总蛋白。5Xloading buffer就是说你取1ul的1.5ug/ul的蛋白,加入4ul的5Xloading buffer。蛋白浓度就为0.3ug/ul。你就去7ul蛋白原液,加入28ul 5Xloading buffer,混匀之后取33.3ul上样。不过我建议你用2X loading,5X容易影响跑胶的效果
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宇文诗畅 生物秀才 发表于 2015-10-15 10:08:26 | 显示全部楼层
Teddydai 发表于 2015-10-14 19:20
首先蛋白浓度为1.5mg/ml,也就是说等于1.5ug/ul。每个孔为10ug的总蛋白。5Xloading buffer就是说你取1ul的1 ...

loading buffer里的溴酚蓝不是起到指示的作用吗?蛋白样品稀释用的不是PBS吗?还有那个5x的话到底是样品蛋白:loading buffer=1:4,还是loading buffer:样品蛋白=1:4啊?我问了好多人 你说是前者 可有人说是后者比才对,我都搞晕了,你可以确定吗?
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宇文诗畅 生物秀才 发表于 2015-10-15 10:17:40 | 显示全部楼层
Teddydai 发表于 2015-10-14 19:20
首先蛋白浓度为1.5mg/ml,也就是说等于1.5ug/ul。每个孔为10ug的总蛋白。5Xloading buffer就是说你取1ul的1 ...

还有个问题就是上样蛋白是必须要稀释的吗?或者说上样蛋白的浓度有什么要求?
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Teddydai 生物秀才 发表于 2015-10-20 19:06:48 | 显示全部楼层
一般样品稀释取决于你的样品,关于样品与5Xloading buffer的关系是1ul的样品:4ul的buffer,我不是说过去1ul的蛋白样品,加入4ul buffer。样品必须用Loading bufer,稀释的比例依据你选择的loading buffer的倍数。如果你研究的蛋白浓度大,你就选择2Xloading buffer,如果浓度特别小,就选择5X的。另外关于1X的loading bufer一般是用于样品是沉淀状态的,比如IP实验的珠子。
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Teddydai 生物秀才 发表于 2015-10-20 19:36:43 | 显示全部楼层
对不起,我今天才发现那天我选错了。你的蛋白样品是1.5ug/ul,需要上10ug的总蛋白,用5Xbuffer稀释,也就是说4ul蛋白样品加入1ul5Xloading buffer,蛋白浓度为1.2ug/ul。取8ul的蛋白加入2ul的loading,95度变性10分钟之后去8.33ul上样。
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Teddydai 生物秀才 发表于 2015-10-20 19:50:02 | 显示全部楼层
宇文诗畅 发表于 2015-10-15 10:17
还有个问题就是上样蛋白是必须要稀释的吗?或者说上样蛋白的浓度有什么要求?

对不起,那天没注意。给你带来困扰。如果你的蛋白浓度很大我建议你还是用2X的oading buffer稀释样品。这样考染或者WB的结果会很漂亮的
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实验室小板凳pro 生物秀才 发表于 2015-10-21 21:30:48 | 显示全部楼层
最后上样样品是1Xloading buffer,样本稀释用的可以是PBS也可以是TBS,具体看你上样样品是用什么试剂了。5Xloading,你上样时用的是1Xloading,那就把5Xloading 稀释到1X 。
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daxue 生物秀才 发表于 2015-10-26 16:06:16 | 显示全部楼层
5乘的不是去1ul 5乘的buffer加4ul的样品么?
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